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来源：未知 |发布时间：2021-04-10 09:27|点击:次
CCPP小鼠模型的建立及鉴定
2.1.1 Mccp的菌落观察及浓度测定结果
F38株在改良MEM-KM2固体培养基中生长7 d后,光照下肉眼可见针尖大小菌落,在200X光学显微镜下可见典型的“煎蛋状”菌落。20 g/L琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，紫外凝胶成像系统观察,目的条带为316 bp,与预期大小一致。
建立的Mccpreal-timePCR检测方法构建标准曲线并求出回归方程式(图2)。该标准曲线对于Mc-cp的Ct值与拷贝数在5.01X10*~5.01X109反应范围内有很好的线性关系，相关系数为0.9946,扩增效率为104%。以此标准曲线计算制备的F38菌液Mccp拷贝数为8.13X105copies/ pL。
2.1.2 Mccp 感染后小鼠症状的观察Mccp 感染
小鼠12 h后,对照组小鼠进食、饮水、活动度等正常,状态良好,48 h内存活为100%;试验组小鼠精神状态较差,蜷缩,后肢瘫软,呼吸急促,鼻部出现少许分泌物,活动度降低,进食减少,大便略稀,出现咳嗽、竖毛、寒战等症状,48 h内存活率为80%。自接种F38菌液12h开始至48h,试验组小鼠体重变化较对照组有显著差异(P<0.05)。
2.1.3 小鼠肺脏病理学检查结果Mccp感染小鼠12h后,无菌剖检可见对照组小鼠腹腔和胸腔均无病理变化,肺脏呈正常粉红色;试验组小鼠腹股沟淋巴结充血,肠系膜淋巴结肿大，肺部眼观病变明显，肺脏充血、肿大。组织切片观察,对照组小鼠肺部组织结构完整,低倍镜下可见终末细支气管分支为呼吸性支气管、肺泡管、肺泡囊、肺泡等结构,肺泡囊以及肺泡构成网状结构。
肺泡壁完好,支气管壁、肺泡壁无充血、水肿,肺泡上皮形态正常,肺泡无萎缩、扩张,且肺泡腔内无渗出物;试验组小鼠同对照组相比,肺组织结构不完整,肺泡壁有明显扩张、充血,肺泡壁水肿,有炎性细胞浸润，局部肺泡扩张,部分区域肺泡囊及肺泡结构不明显。肺组织病理学评分结果显示,试验组小鼠平均评分为15.77,对照组小鼠平均评分为2.03,二者呈现极显著差异(P<0.001)。
2.1.4小鼠肺部Mccp载量检测结果
Mccp感染小鼠12h后,经Mccpreal-timePCR测定,试验组小鼠肺部Mccp载量为5.9X10*copies/pL,同对照组相比差异极显著(P<0.001),该检测结果在标准曲线的检测范围内,判断为结果阳性。
2.2 肺组织中IL-17 及其相关细胞因子、趋化因子、趋化因子受体mRNA水平测定结果Mccp感染小鼠12 h后,试验组小鼠肺组织IL-17 mRNA承章提对照组的330倍,差异极显著(P<0.01)。但在感染早期,试验组小鼠肺组织中RORγt mRNA水平较低，与对照组差异不显著(P>0.05)。 试验组IL-1β mRNA水平是正常对照组小鼠的6.5倍,差异显著(P<0.05)。试验组IL-23 mRNA水平与对照组无显著差异(P > 0.05)。
试验组小鼠肺组织中IL-27和IL-6 mRNA水平显著升高，分别为对照组的9.5倍(P<0.05)和236倍(P<0.01)。此外,IFN-γ 和TNF-a mRNA表达水平较低，试验组小鼠同对照组差异不显著(P>0.05)。具有趋化中性粒细胞作用的趋化因子CX-CL1、CXCL2和CXCL5的mRNA水平较高,其中试验组小鼠肺组织中CXCL1 mRNA水平与对照组差异显著(P<0.05),CXCL2和CXCL5 mRNA水平与对照组差异极显著(P<0.01,P<0.001)。
试验组小鼠肺组织中G-CSFmRNA水平较对照组显著升高，是对照组的182倍，差异极显著(P<0.001)。试验组的CXCR3 mRNA水平与对照组差异不显著(P>0.05)。参与单核细胞和粒细胞募集的CCL2和CCL20在试验组中mRNA水平较高，分别是对照组的5.6(P<0.01)倍和24.5倍(P<0.01)。介导单核细胞、T细胞和DCs等细胞趋化的趋化因子受体CCR2.CCR4和CCR6的mRNA表达，试验组同对照组差异不显著(P>0.05）。
2.3血清及肺组织匀浆上清液中IL-17的ELISA
测定结果Mccp感染小鼠24h后,试验组小鼠血清和肺组织匀浆上清液中IL-17的蛋白表达水平与对照组差异显著。其中试验组血清中IL-17 浓度高达1 327.6 pg/mL,与对照组差异极显著(P<0.001),肺组织匀浆上清液中IL-17为159.5 pg/ mL,是对照组的2倍,二者之间差异极显著(P<0.01)。
2.4肺组织中中性粒细胞和巨噬细胞数量变化的检测结果
Mccp感染小鼠12h后,肺部CD45.2+细胞中，试验组小鼠Ly6G+CD11b+细胞的占比与对照组差异显著(P<0.05) ,试验组F4/80+ CD11b+细胞占比较对照组高，但无显著差异(P> 0. 05)。Mccp感染小鼠早期,肺部有大量的中性粒细胞和巨噬细胞存在,试验组小鼠的中性粒细胞和巨噬细胞的数量同对照组小鼠相比差异极显著(P<0.01,P <0.001)。其中试验组小鼠肺部中性粒细胞数量达1.25X10°个,巨噬细胞数量达3.25X105个。
3讨论
Mccp免疫致病机制的研究--直受限于理想的动物模型为数善为受试动物构建CCPP山羊感染模型因受到了山羊来源和遗传背景等多种因素的制约而难以开展。众多试验研究中,小鼠均作为研究慢性肺部炎症发病机制的有效模型动物。本试验借鉴MP构建小鼠模型方法，根据预试验探索最终采用腹腔接种F38菌液的方式感染小鼠,成功构建了CCPP小鼠模型。根据CCPP患畜的临床症状及病理组织学分析判定,Mccp诱发的山羊肺部损伤呈典型的炎症反应。
在临床病理模型和小鼠感染模型中,均可观察到肺部严重的血管反应,其特征是充血、有出血区和偶尔有血栓形成,此外，肺泡、肺泡壁、支气管腔等部位出现大量红细胞浸润。红细胞不仅参与维持机体免疫功能,而且为炎性细胞的浸润提供了充足的氧气。IL-17+细胞保护宿主抵抗上皮和黏膜表面的细胞外细菌和真菌感染,而且IL-17R信号传导对G-CSF和CXC趋化因子产生和肺部防御微生物人侵至关重要。
为了控制感染,IL-17通过诱导上皮细胞分泌粒细胞生成因子(如G-CSF、GM-CSF)和趋化因子(如CXCL1.CX-CL2和CXCL5)来发挥其中性粒细胞刺激功能,其促进中性粒细胞趋化性。同时,L-17 诱导淋巴细胞、树突状细胞和单核细胞化学引诱物的产生来增强机体抵御能力[28]。本研究结果显示,Mcep感染BalbL/c小鼠早期,IL-17的mRNA水平显著增高,且其翻译的蛋白显著增高,多种与IL-17介导的炎症反应相关的细胞因子、趋化因子转录水平显著升高。
本研究中,IL-17蛋白表达水平在感染Mccp 24h后显著增高。在Mccp诱导的肺部炎症反应早期,IL-17主要募集中性粒细胞和巨噬细胞到达肺部,在完成病原清除和杀伤的同时,巨噬细胞又及时控制中性粒细胞的数量,以防止因其较强的细胞毒性作用而对组织造成损伤，如ROS.颗粒蛋白酶和中性粒细胞胞外诱捕网络(neutrophilextracellulartraps,NETs)等。
而且中性粒细胞的过度活跃易造成大量的细胞因子产生,从而造成“细胞因子风暴”。因此,本研究初步提出假设,Mccp人侵机体肺脏早期,IL-17迅速表达升高,从而通过IL-17/IL-17R信号转导作用于下游靶细胞,如上皮细胞、肺泡细胞等,靶细胞分泌趋化因子以诱导中性粒细胞和巨噬细胞参与肺部炎症反应,从而介导清除Mccp以保护机体不受损伤。巨噬细胞在此过程中扮演吞噬病原以及调控局部中性粒细胞数量的功能。但是,其作用的靶细胞及其效应细胞(如中性粒细胞、巨噬细胞等)发挥的具体作用还有待进一步研究。
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