啮齿类动物手术器械厂家为什么少？
来源：未知 |发布时间：2021-04-09 10:48|点击:次
1材料和方法
1.1实验材料
实验动物：本研究中小鼠的饲养和使用参照《杭州师范大学实验动物管理办法》，受杭州师范大学动物管理委员会的监督。所用材料为SPF (specifie pathogen free )级别小鼠，购自杭州师范大学实验动物中心。
实验用受精卵由健康7周龄C57BL/6J雌鼠30只与雄鼠10只交配而得;假孕母鼠由健康7周龄ICR(Institute of Cancer Research )雌鼠20只与结扎雄鼠7只交配检阴栓后而得。
实验材料:胎牛血清(Gibeo ,10099-141 ) ，非必需氨基酸(Gibco ,11140-050 )，丙酮酸钠(Gibco ,1 1360-070) ，谷氨酰胺(Gibco ,35050-061 ) ，青霉素链霉素(Gibco ,15140-122 ),0.05%胰酶~ EDTA (Gibco ,25300-054 ) ，DM EM ( Gibco , 11960-069 )，DPBS ( Gibco , 14190-250 )，ESGRO mLIf (M ilipore, ESG1107 )，M16(Sigma ,M7292 )，干细胞129细胞系W4 ,来源于杭州师范大学张遵义教授实验室。
1.2 实验方法
1.2.1 原位杂交
收集野生型C57BL/6J雌性小鼠P1、P3、P5的卵巢,通过4%多聚甲醛(PFA )固定、石蜡包埋组织切成12 um厚度,经4%PFA固定、蛋白酶K处理、乙酸酐处理后,杂交液室温封闭1 h ,加入地高辛标记的RNA探针在65 ℃条件下孵育过夜.寡核苷酸引物根据小鼠cDNA通过PRIM ER3软件设计:Riok3 For:5'-ACCCCTCAAA ACACAGTATCC；Riok3 Rev : 5'-GTTCCTTCTTCTCGTGTAGACG。次日，样品分别经SSC、Tris-HCl缓冲液浸洗，加入偶联碱性磷酸酶的抗地高辛的抗体经4C孵育过夜后再次用T ris- HCl缓冲液浸洗,最后加入底物BM Purple(Roche ,11442074001 )显色,在PBS缓冲液中终止反应，加伊红对染，中性树脂封片、拍照。
1.2.2 免疫组化
收集野生型C57BL/6J雌性小鼠P1、P3、P5的卵巢，通过4% PFA固定、石蜡包埋。组织切成5 μm厚度,经脱蜡水化、高压抗原修复、H2 O2处理、0.1% PBS-Triton X-100清洗、5% BSA室温封闭后加入一抗Riok3单克隆抗体(proteintech ,13593-1-AP)，4℃孵育过夜。次日加入二抗，经DAB显色(V ECTOR ,SK-4100)、快红对染后中性树脂封片、拍照。
1.2.3基因打靶载体的构建
以基因打靶的干细胞基因组DNA为模板,在Riok3基因起始密码子上游扩增4 kb作为同源重组的长臂(5，arm ) ，在起始密码子下游扩增2.5 kb作为同源重组的短臂(3’arm)，分别进行TA克隆。然后通过酶切、连接的方法将两个片段整合到含有Neo(指新霉素抗性基因，选择性筛选的阳性标记)和DTA(指白喉毒素A亚基的负性筛选标记)筛选基因的打靶载体内，其中LoxP-Lox P-Neo(LoxP指Cre-Loxp重组酶系统中在外显子两侧的序列)位于两个重组臂的中间。构建成功的载体进行测序，测序正确后用Qiagen的无内毒素质粒抽提试剂盒进行质粒抽提。
1.2.4 胚胎干细胞基因打靶
用限制性内切酶Pac I (N EB ,井R0547L )将300μg基因打靶载体线性化，经过酚氯仿纯化后用于胚胎干细胞基因打靶。复苏MEF和NeoR MEF细胞，用丝裂霉素C处理的M EF细胞作为基因打靶ES细胞的饲养层细胞，在ES细胞生长至指数生长期时用于基因打靶实验。将收集的ES细胞与线性化的打靶载体DNA混合、静置，转移至电击杯中，用伯乐电击仪电击,冰上静止后，铺到含有NeoR MEF的培养皿中，从第2天开始，细胞每天换含有G418 (Sigma,A1720-5G )的新鲜培养基。G418筛选的第8天，挑单克隆，在解剖镜下选取饱满的、边缘清晰的细胞集落，挑至96孔板中。
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