进口宠物医疗器械市场为什么那么好？
来源：未知 |发布时间：2021-04-08 08:59|点击:次
实验方法
1.3.1实验动物分组及造模后给药
参照文献构建小鼠肺癌模型。随机将30只雌性ICR小鼠分成3组,每组10只。分别设立Con组,Ure组和Ure-HU组。其中,Ure组和Ure-HU组腹腔注射800mg/kg乌拉坦溶液,每周2次,连续10周。Con组注射等量的生理盐水。10 周后,停止注射乌拉坦溶液。对Ure-HU组腹腔注射500 mg/kg的HU药物,连续21d。Con组和Ure组注射等量的生理盐水。第13周处死取材。
1.3.2 HE染色
小鼠处死后,取出肿瘤样本,进行初步的形态学鉴定。将肿瘤样本进行固定、脱水、透化、浸蜡、石蜡包埋,制备石蜡切片。石蜡切片进行脱蜡、水洗,并利用苏木精和伊红染料进行HE染色。最后封片并在镜下观察并成像。
1.3.3基因表达分析
按照说明书,利用TRIzolreagent提取正常肺组织肿瘤组织和给药后肿瘤组织的RNA, RNA样品置于-80保存。采用天根快速反转录试剂盒将RNA反转成cDNA, -20C保存。根据GeneBank中基因的原始序列设计下列qPCR引物,并由吉林省库美生物科技有限公司合成。TET1, F: AGCTGGATTGAAGGAACAGG, R: GTCTCCATGAGCTCCCTGAC;TET2, F: AGAGCCTCAAGCAACCAAAA, R: ACATCCCTGAGAGCTCTTGC; TET3, F: TGCGATTGTGTCGAACAAATAGT，R: TCCATACCGATCCTCCATGAG;HPRT,F: CAGTACAGCCCCAAAATGGT,R: CAAGGGCATATCCAACAACA。
采用荧光定量试剂盒进行实时荧光定量PCR,反应条件按照95°C 3 min,(95°C 10 s, 609C 20 s,72C30s)40个循环,72C10min,添加溶解曲线。在实验中,每一个检测样品都设有三个重复。选择HPRT为内参基因计算相对表达量时采用2公式，样品数目各为3个。
1.3.4 蛋白表达分析
利用IP细胞裂解液对组织进行裂解,BCA比色法测定蛋白质浓度，取相同质量的蛋白质样品,加人蛋白质加样缓冲液，95C水浴8 min 变性。配置12%分离胶和5%的浓缩胶，上样后跑电泳。利用电转膜仪进行转膜。将转移了蛋白印迹的PVDF膜浸泡于5% BSA溶液中，室温,摇床上封闭1 h。贴膜孵育相应稀释的抗体，4C过夜。加入相应的稀释二抗(山羊抗兔或者山羊抗鼠),37C孵育1 h。配置显色液,采用凝胶成像仪进行观察并成像。
1.3.5 ELISA分析
参照《白头翁总皂苷改善肺癌小鼠肺部微环境的作用及机制研究》，检测小鼠瘤体中VEGF、IL-6和TNF-a水平。小鼠处死后,提取正常肺组织、肿瘤组织和给药后肿瘤组织，采用ELISA法检测小鼠瘤体中VEGF、JL-6和TNF-a的水平变化。
1.3.6小鼠自主活动检测
将小鼠放人主活动记录仪中,适应2min。正式实验开始后,记录小鼠5 min内活动次数,连续4 d。
1.4统计学方法
采用SPSS 16. 0统计软件进行分析小鼠重量,结节个数,肺重量,生存曲线,自主活动次数以及荧光定量PCR数据,独立样本t检验,P< 0.05为差异有显著性。
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