欧洲鳗鲡感染评估的比较成像

　　摘要

　　本研究比较了诊断成像工具在检测安圭拉(L.)寄生鱼鳔线虫Anguillicoloides crassus方面的应用，并重点研究了超声波，试图开发一种非破坏性的现场诊断测试。超声波的使用可以在不减少死后极度濒危的欧洲鳗鱼数量的情况下诊断寄生虫。在初步研究中，对鳗鱼进行了计算机射线照相、计算机断层扫描、磁共振成像、14 Mz高端超声和5 MHz低端便携式超声检查，并将结果与尸检结果进行了比较。这种超声扫描技术没有产生任何有希望的结果。第二批鳗鱼使用相同的高端和低端超声波进行了检查，但采用了不同的扫描技术，并将结果与尸检结果进行了比较。第二项研究从下方沿中线扫描，可以检测到与中度感染动物相关的异常。本研究中使用的鳗鱼均未受到严重感染:因此，对于在这些动物中使用超声波，我们无法得出任何结论。总体而言，发现这些技术在诊断轻度感染者方面都没有用:因此，没有一种诊断成像工具足够灵敏，可以取代尸检进行明确诊断。

　　介绍

　　欧洲鳗鲡(Anguilla Anguilla(l.))是整个欧洲生态和经济上重要的物种(Dekker2003:Voge12010)。鱼市场最近已经通布全球;因此，该物种在全球范围内也很重要(Dekker 2003)。据报道，在过去几十年里人口在其分布范围内急剧下降(Dekker2003)。库存处于历史最低水平，招聘也处于历史低位(ICES 2010)。因此，a.anguilla被列为极度濒危物种(Vogel 2010:CITES 2011)。

　　根据Dekker(2003)的说法，没有一个单一的假设可以证明是人口迅速下降的原因。作者认为，几个致病因素更有可能产生协同效应:这些因素包括污染、栖息地丧失、海洋气候变化、过度开采以及疾病和寄生虫的人为传播(Moriarty&Dekker 1997):其中一种寄生虫是Anguillicoloides crassus(Kuwahar ,Niimi和Itag-aki，1974)，这是一种起源于日本的淡水线虫(Taraschewski等人，1987)已被广泛研究。这种寄生虫是在20世纪80年代初通过将受感染的日本鳗鱼进口到德围而意外引入欧洲的(Kaie 1991)，并于1987年在英围首次报道(Kennedy&Fitch 1990)。它已经蔓延到整个欧洲，现在无处不在(ICES2010)。

　　Anguillicoloides crassus成虫位于鱼鳔腔内，卵通过气动管道离开，在水中孵化(DeCharleroy等人，1990)。虽然这是一种淡水寄生虫，但卵可以在各种盐度下孵化，并对中间和副产宿主保持感染性(Kirk，Kennedy&Lewis 2000a);然而，随着盐度的增加，存活率和传染性会下降。自由生活的第二阶段幼虫被中间宿主吃掉，在欧洲，中间宿主包括各种淡水环状桡足类和一些河口桡足类(Kennedy&Fitch 1990:KirkLewis&Kennedy 2000b:Kirk等人2000a)。旦鳗鱼吃掉了受感染的中间宿主，幼虫就会穿透消化道，然后穿过体腔和鱼鳔壁迁移(Haenen等人，1989)。在A.anguilla中，包括各种鳗鱼食物生物在内的共生宿主是生命周期中非常重要的一部分(De Charleroy等人,1990年:Thomas和0llevier，1992年:Moravec和Konecny，1994年;Sz ekely，1994年，Moravec，1996年;Moravec&~Skor lkov'a 1998)。因此，a.anguilla可以在其体腔内从副产底栖鱼类那里获得大量幼虫，这些鱼类是其饮食的重要组成部分，也可以直接食用中间宿主。

　　根据Kennedy(2007)的研究，A.crassus在欧洲的迅速传播可能与它与太平洋鳗鱼物种的生命周期存在显著差异有关。首先，在欧洲，有更广泛的中间宿主，使线虫能够在新鲜、河口和盐水条件下完成其生命周期。其次，寄生虫利用副基因宿主，这在其太平洋生命周期中尚未有报道(Nagasa wa，Kim&Hirose 1994)这使得年幼的A. anguilla通过摄入受感染的桡足类动物获得寄生虫，而年长和较大的鳗鱼则通过摄入受污染的鱼类获得寄生虫(Kennedy2007)。第三，与太平洋鳗鱼相比，A.crassus幼虫似乎需要更长的时间才能穿过欧洲鳗鱼的鱼鳔壁，从而引起更强烈的炎症反应。与太平洋鳗鱼相比，Taraschewski(2006)指出，作为一个物种，a.anguilla是这种寄生虫的免疫原生宿主，似乎无法对其产生有效的免疫反应，正如Knopf和Mahnke(2004)的实验所证明的那样。

　　欧洲鳗鱼中由A.crassus引起的病理变化已有详细记录。这个寄生虫会导致鱼鳔壁纤维化和增厚，血管扩张粘膜和粘膜下层出现炎症和水肿性病变。迁徙的幼虫周围会出现肉芽，并经常出现出血(Moln'ar等人，1993年:Haenen，vanBanning&Dekker,1994年:Mol'ar，1994年)以前感染的鳗鱼通常会有增厚的纤维化鱼鳔壁色素积聚严重，在最严重的情况下，管腔会塌陷(van Banning&Haenen 1990:Moln ar等人1993)。由于这些病理变化，鱼鳔功能失调。Wue rtz、Taraschewski和Pelster(1996)表明，由于a.crassus成虫改变了气体沉积机制氧气对鱼鳔的贡献减少，因此其作为浮力和静水器官的功能受到阻碍。在实验室条件下，寄生虫还会导致游泳能力下降(Sprengel&Lu€ chtenberg 1991)。除了寄生虫在100%海水中在鳗鱼体内存活长达6个月的可能性(Kirk等人，2000b)外，这些生理效应被认为是欧洲鳗鱼招募减少的部分原因(Dekker 2003)。换句话说，人们认为A. crassus感染会影响A. anguilla在迁徙过程中的垂直运动，并在整个迁徙到产卵地的过程中直接对宿主造成压力(Kirk 2003)。由4.crassus和其他病原体引起的膀胱疾病很难通过外部检查进行评估，最常见的是通过尸检发现。目前，射线照相是检测与这种线虫相关的病理变化的唯一无损检测方法，包括膀胱的气体、蠕虫和渗出物含量(Beregi等人,1998;Sv ekely，Molnar&R acz，2005)。然而，这种方法是作为一种基于实验室的研究工具开发的，目前不适合进行实地研究。计算机断层扫描(CT)也被用于显示鳗鱼鱼鳔的气体含量、内部结构和壁厚(Sz'ekely等人，2004)。Szekely等人(2004)发现，他们的结果与尸检和常规放射学结果高度相关。为了估计A.crassus在河流流域的流行率，需要种非致命、经济可行、可靠的方法，可以在现场运输和使用。超声波可能就是这样一种技术。

　　它作为多种物种的诊断工具有着悠久的历史并被广泛用于鱼类成像，主要用于确定亲鱼管理中的繁殖状态(Mar tinRobichaud&Rommens 2001)健康的鱼鳔充满了气体，这种组织-空气界面对超声波具有很强的反射性。这将导致声束在它和探头之间来回反弹，并导致图像上出现平行于鱼鳔壁真实位置的水平线。这些被称为混响伪影(Penninck 2002);它们较弱，并且以探头和鱼鳔壁之间距离的相等或倍数间隔开(Cartee 1995)。此外，当超声波束遇到以不同速度传输声音的介质时，如气体(超声的不可穿透屏障)和阻力最小的流体的情况，一部分未被反射但被传输的波束会发生折射或弯曲(Penninck 2002)。在对健康个体进行超声波检查时，鱼鳔结构的性质会产生这些伪影，这意味着没有这些伪影将表明存在与a. crassus感染一致的异常。

　　本研究调查了超声波作为便携式诊断工具在评估欧洲鳗鱼鱼鳔健康状况方面的潜在用途，并将这些结果与使用磁共振成像(MRI)、CT和传统数字射线照相的结果进行了比较。

　　材料和方法

　　初步影像学研究

　　五条鳗鱼被送往皇家兽医学院进行诊断成像。其中四个来自泰晤士河的淡水集水区，那里有很高的a.crassus流行率，一个来自洛豪德湖集水区，人们认为那里没有这种寄生虫。用300mg L苯佐卡因对鳗鱼进行终末麻醉，然后将其放入单独的塑料袋中，并进行唯一标识。使用计算机放射线照相术(Agfa ADC Solo;Agfa HealthCare UK Ltd)，两个左侧视图一个头部视图和一个尾部视图覆盖每条鳗鱼的整个长度，以及拍摄了鱼颅半部的背腹视图，将鱼直接放置在射线照相暗盒上。

　　在射线照相后，可以筛查鳗鱼中是否存在金属，所有五条鱼都使用1.5特斯拉的MRI同时进行扫描(飞利浦Intera、飞利浦医疗保健、Reigate)。然后使用四探测器行螺旋CT扫描仪(Somatom Volume Zoom，Siemens AG)对每只鳗鱼进行CT成像，设置如下:120kVp，100 mAs，旋转时间1秒，探测器间距1.66.图像被处理成两组:第一组具有3mm的重建切片宽度、1.5mm的重建增量和软组织图像重建算法(西门子B40f)，第二组具有1.5mm的重建切片宽、0.7mm的重建增量以及骨图像重建算法。CT检查后，每只鳗鱼经直肠注射5-10ml硫酸钡 (ыitopsio:Sanchemia Diagnostics KLtd)，用水稀释至5%重量体积。在钡剂注射后重复进行CT成像，并对每只鳗鱼的半头进行左侧和背腹侧放射线检查。

　　随后，将鱼放置在右侧卧位，头部向左，并使用14 MHz线性换能器进行谐波超声(GELogig9.通用电气医疗系统)扫描，以进行高端超声检查。从通气口开始，将通气口和胸鳍之间的扫描区域分为探头长度段(5cm)。在侧线处拍摄每个部分的图像:首先纵间拍摄:然后横向拍摄，每个部分拍摄三张图像并相应地标记。使用使用5MHz线性换能器的低端便携式超声机(SonoSite Vet 180plus;FUJIFILMSono-Site ltd)重复该协议。成像完成后，测量每只鳗鱼的总长度和重量并进行尸检。取下除肾脏外的所有器官，在原位拍摄鱼鳔照片。测量了鱼鳔的长度，然后解剖出这个器官。拍摄了完整的鱼鳔的照片，并再次在整个长度上打开。Lefebvre.Contournet和Crivelli(2002)开发的膀胱退化指数(SDI)用于每个膀胱。该指数基于三个单独的评分。

　　大体病理学标准为0、1或2(表1)，然后将其加在一起，得出6分，其中0分为正常膀胱，6分为严重膀胱。还计算了Palstra等人(2007开发的长度比指数(LRI)。该指数基于观察到的鱼鳔因随后的感染而变厚和变短，通过将鱼鳖长度除以全身长度来计算。然后根据Beregi等人(1998)描述的标准，将每个鱼鳔从5分中分出来，如表2所示，其中1分为未感染的鱼整，5分为严重感染的。

　　使用后处理DICOM查看软件(0sirix版本3.9.2.32位，开源”)来评估获得的所有诊断图像。对每组放射线照片、CT、MRI和超声图像进行形态学描述和鱼鳔长度测定。

　　腹部超声成像研究

　　在对初步影像学研究结果进行分析后，14条鳗鱼被带到皇家(迪克)兽医学院进行超声波检查;其中3人来自帕里特河，11人来自北约克郡的乌斯河。用300mgL“苯佐卡因对鳗鱼进行终末麻醉，并进行唯一鉴定。与之前一样使用了相同的两台超声波机器，但为了获得更好的图像，协议进行了更改。如前所述，被扫描的区域被分成几部分，但不是沿着侧线扫描，而是使用一块塑化的纸板从下方沿着中线单独扫描每条鳗鱼，纸板上有一个适合传感器尺寸的孔。

　　在两次扫描之后，测量了每条鳗鱼的重量和长度，并按照与之前相同的程序进行了尸检。使用相同的查看软件确定每个膀胱的SDI、LRI和感染严重程度。

　　结果

　　在本文的初步工作中，一条来自洛蒙德湖集水区的鳗鱼(假定没有A.crassus)在尸检时被发现因鱼鳔腔内存在小蠕虫而轻度感染。这条鱼不是主要影像学研究的一部分。

　　初步影像学研究

　　来自泰晤士河的四条鳗鱼中，两条轻度感染另外两条中度感染了A.crassus。只有来自洛蒙德湖集水区的鳗鱼没有寄生虫。被归类为无感染的鳗鱼(5号鱼)的鱼鳔在CT(图1a)放射学(图1b)和MRI(图1c)检查中显示出充满气体的管腔，没有蠕虫的迹象。气动管道充满气体，可以用这三种诊断工具清楚地看到，高端和低端超声检查未发现明显异常(图2)存在混响伪影，其中一个奇迹网(一束紧密排列的毛细管段，通过逆流气体交换机制控制浮力)在高端超声波机器的纵向视图中很容易被尸检时，鱼鳔有一个无蠕虫的管腔和一个壁透明且薄壁(壁厚<1mm)(图3)其中一条中度感染的鳗鱼(1号鱼)的鱼在CT(图4a)和放射学(图4b)检查中显示出蠕虫的轮廓、增厚的壁和整个器官的圆形。MRI图像显示同样的发现，但也显示了管腔和鱼鳔尾端的液体塌陷和纤维化(图4c):高端和低端超声检查未发现明显异常(图5)。

　　尾部萎缩。它也是部分不透明的，全身有少量色素沉着。管腔内有大型蠕虫和渗出物(图6)。另一条中度感染鱼鳔的鳗鱼(2号鱼)在纵切面上显示鱼警表面有一些不规则，这在低端超声波检查中也可以看到。横问视图没有显示这些不规则性，但与未感染的膀胱相比，这些图像中的器官表面具有高反射性(图2)被归类为轻度感染的两条鳗鱼鱼(3号和4号鱼)的结果相似。他们在CT、放射学或MRI检查中显示管腔充满气体，没有虫的迹象。高端超声纵向视图显示彗星尾部伪影(一种混响)，但该视图或横向视图中没有可见的异常，低端超声检查未发现异常。尸检时，鱼壁薄而透明(壁厚<1mm)，管腔内有小虫。

　　表3显示了每只鳗鱼的计算SDI和LRI，以及根据表2中关于术后、放射学、CT和MRI检查的标准得出的感染严重程度等级。超声波检查没有给出严重程度等级。尸检时，未感染的鱼SDI为1.严重程度为1/5.中度受影响的鱼SDI为3-4.严重程度为3-5.轻度感染鳗鱼的感染严重程度为2/5.SDI为1-2.由于这些工具的性质，无法从CT或超声图像中准确测量长度。LRI范围为0.12至0.13.初步成像中使用的鳗鱼尸检测量结果见表S1(1-5号鱼)。

　　腹部超声成像研究

　　怕里特河的三条鳗鱼中有一条轻度感染，乌斯河的十一条鳗鱼中也有五条感染，其中三条中度感染，两条轻度感染:每只鳗鱼的SDI、LRI和感染严重程度如表4所示。LRI范围为0.05至0.14。

　　最低的数字与病理学上最差的鱼不对应。户检数据如表S1所示(6-19号鱼):对未感染鱼的超声波检查没有发现任何异常:存在混响伪影，代表鱼鳔壁的线条光滑完整。横向视图允许对气动管道进行可视化。尸检时，这些无寄生虫的鱼鳔有透明薄壁的壁(壁厚<1mm)管腔无蠕虫。其中一条中度感染的鳗鱼(16号鱼)在高端和低端超声波检查中显示鱼鳔尾端不规则:本节未发现混响伪影。这些异常在纵向和横向视图中都可以看到。在低端超声波检查期间，在该区域观察到一些起伏的运动，尸检时，这个鱼鳔里有两条大蠕虫和七条小蠕虫，主要在尾端，这端的壁部分不透明且不规则，全身都有色素沉着。在低端超声波检查中-条轻度感染的鳗鱼(18号鱼)也出现了较低程度的波动运动。经尸检，这条鳗鱼的鱼鳔腔内有六条小蠕虫。另一只轻度感染的鳗鱼，其鱼鳔腔内存在少于三条蠕虫，鱼壁没有明显的病理变化，超声检查没有显示任何可见的异常。

　　讨论

　　本研究的结果表明，没有一种诊断成像工具能够单独提供足够的信息来灵敏地检测活鳗鱼中的A.crassus;因此，尸检仍然是确诊的首选在初步影像学研究中，与未感染的鳗鱼相比，超声检查没有显示轻度或中度感染的鳗鱼有任何明显的可观察变化。这被认为是因为鳗鱼侧卧，沿着侧线扫描;因此，超声波束在到达管腔中的任何其他内容物之前，必须穿过器官的充气部分。高端和低端超声波的结果相似，尽警高频探头可以看到更多细节。目前尚不清楚对严重感染的鳗鱼进行超声波扫描是否会显示出明显的变化。然而，由于器官的结构，超声波很可能可以检测到严重感染的鳗鱼，其鱼鳔壁增厚且有疤痕，因为它含有的气体较少:与第二组鳗鱼一样，从下方沿腹中线进行扫描得到了更有希望的结果。这种方法是鉴于这样一个事实而试验的，即如果鱼鳔腔内含有渗出物或蠕虫，这些内容物将位于器官的最低部分:因此，超声波束在到达气体之前不必穿过气体。从结果来看，有多个(>5个)或更大蠕虫的鱼鳔的部分没有混响伪影这与蠕虫的存在有关。此外，如果考官保持探头不动，可以看到起伏的运动。尽警第二种扫播方法在识别中度感染的鳗鱼方面产生了更好的结果，但它仍然无法区分轻度感染和无寄生虫的鳗鱼:遇到的另一个问题是，当鱼鳔壁在图像上没有显示为平滑的实线时，不知道这是由于异常还是光束击中了其他东西，如器官侧面或气动导管。奇迹网很容易被辨认出来，因为它充满了血液。超声成像可以很快，这表明它很容易适用于麻醉的鳗鱼，而没有与长时间检查相关的风险。然而，这项研究的结果表明超声波不是检测这种感染的理想工具，特别是在轻度病例中。

　　影像学和CT检查提供了类似的关于鱼鳔感染状况的信息。与射线照相相比，CT能够提供更多关于鱼鳔内部结构、气体含量和壁厚的信息而射线照相与Sz'ekely等人(2004)在他们的研究并发现CT还能够更准确地确定存在的蠕虫数量及其位置。所研究的鳗鱼中，没有一条感染得如此严重，!以至于它们的鱼鳔腔内没有残留气体:因此，无法评论在这些条件下图像会是什么样子Sz'ekely等人(2004)报告称，一旦管腔内没有气体，CI就无法提供壁厚或蠕虫数量和位置的数据，射线照相检查也有类似的局限性(Beregi等人，1998年:Sz’ekely等，2004年:Sv'ekeley等，2005年)。在这项研究中钡剂有助于确定气囊实际上是在肠道内还是在另一个结构中，如鱼鳔或气管，特别是在放射线照片上，遇到的一个问题是，只有在存在大型蠕虫的情况下，这些放射线照相和CT检查的结果与未感染或中度感染的鳗鱼的尸检结果具有很好的相关性。两条轻度感染的鳗鱼在X光片上看起来很清楚CT图像，但验尸研究显示thcir泳梯内腔内有小蠕虫。MRl以前没有用于对细胞梯子进行成像，但也有类似的局限性;即使这种方式显示出最详细的细节，包括看到液体和坏死组织的能力，也很难检测到轻度感染。据推测，MRI能够在严重感染的细胞中显示异常，而没有气体，这是放射照相和OT无法做到的。这项研究的结果表明，这些高cnd诊断工具单独检测严重感染并不敏感，可能不会产生与死后检查相同的有限诊断。因此，如Székely等人(2004)所述，这些仅被推荐作为诊断的补充方法，主要用于rescarchPurposcs。Bcregi等人(1998)开发的感染严重程度与SD有很好的相关性!由Lefebvre等人(2002)建立，但后者的onc更容易评估，这是该指数的目的。在此获得的LRl结果。

　　研究似乎没有遵循这样的假设，即最小的比例属于鱼鳔受损最严重的鳗鱼(Lefebvre等人，2011)，尽管这可能因没有一条鳗鱼受到严重感染而产生偏差。的初步调查中，在洛蒙德湖流域内发现了被认为没有寄生虫的4.crassus，这一惊人的发现表明了这种寄生虫已经变得多么普遍，以及它在新的生态位中是多么容易建立起来。在其他河流中也发现了类似的模式

　　在这项研究系统例如，西班牙西北部的RoEsva几乎没有人为改变，但即使在这条近乎原始的河流中也有A.crassus的存在(Costa Dias等人:2010)。这种寄生虫的传播不仅仅是由于人类行为，也可能是由于中间宿主、副宿主或最终宿主的迁移，或是捕食者对受感染鳗鱼的替代(Kirk 2003)。

　　Kirk等人(2000b)指出，黄鳝在迁徙和开始性腺分化之前，可以在淡水或沿海水域生活长达27年(Naismith&Knights1993):因此A. crassus的全面影响尚不清楚，因此开发新的方法来监测这种寄生虫的进展至关重要。一种可能是使用Lefebvre等人(2011)建议的工具组合，他们建议从无线电诊断图像中计算LRI。这个想法的主要问题是，除了A.crassus感染之外的因素可能会影响鱼鳔的测量。此外，在射线照片上测量长度取决于膀胱腔内气体提供的对比度;因此，在温和或者非感染病例的长度测量可以被认为是准确的，因为整个鱼鳔都充满了气体。在更严重的感染中，当鱼鳔部分充气或完全纤维化时，长度测量无法准确，因为不知道射线照片上看到的气体阴影是否对应于鱼整的整个长度。这是从本研究中获取的图像中测量器官长度时发现的主要问题。

　　在陆生动物中，粪便检查是检测其卵通过冒肠道释放的寄生虫的最常见方法之一;这也可以用于鳗鱼。另一个可能的发展是基于分子的检测技术，例如Jefferies,Morgan&Shaw(2009)开发的用于检测这种寄生虫的最终(犬科动物)和中间(软体动物)宿主中的线电Angiostrongylus vasoru的技术。这些作者开发了一种实时PCR检测方法，能够检测犬血液和粪便中的第一阶段幼虫，光肩星生物。在鳗鱼或中间宿主中开发一种类似的a.crassus检测方法可能是监测这种寄生虫在野外的下一步。这些测试具有降低其他诊断测试(如成像)检测限的明显优势。另一个优点是，如果可以检测到中间宿主的幼虫阶段就不需要杀死鳗鱼来确定寄生虫是否存在于某条水道中。然而，这很难在现场使用。总之，超声波可用于观察中度感染A.crassus的鳗鱼的变化，特别是那些在鱼鳔腔内有蠕虫和渗出物的鳗鱼。然而，它无法区分轻度和无寄生虫的样本，需要更多的工作来确定严重受影响的鳗鱼中会出现什么。鉴于A. crassus的传播速度很快，需要一种灵敏的检测来确定是否没有感染，但目前，诊断成像不能取代尸检作为一种明确的诊断工具，因此需要更多的调查。