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来源：未知 |发布时间：2021-04-09 10:55|点击:次
胚胎干细胞阳性克隆筛选
将96孔板胚胎干细胞单克隆用碱裂解法提取基因组DNA ，并用乙醇沉淀，以得到的基因组DNA为模板，用PCR的方法进行胚胎干细胞阳性克隆筛选。为鉴定5'arm是否重组,将正向引物设计在基因组上5'arm。上游200 bp以外，反向引物设计在基因打靶载体5，arm的下游；为鉴定3'arm是否重组，正向引物设计在打靶载体3' arm的上游，反向引物设计在基因组上3’arm下游200 bp以外。只有当两个PCR条带大小都正确，才可以确定这些克隆发生了同源重组,作为阳性克隆。
1.2.6 基因打靶小鼠模型的构建
1.2.6.1 超数排卵
向供体雌鼠腹腔注射孕马血清促性腺激素(pregnant mare serum gonadotropin , PMSG )10 IU ,46~48 h后再注射人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin ,HCG)5 IU 。随后将其与雄鼠合笼过夜，次日清晨7 :00检查阴栓(见栓后标记为EO .5)。
1.2.6.2囊胚的获取
小鼠见栓后第3天(E3.5)，用1 mL注射器抽取冲卵液,将针头插入输卵管子宫体结合处，将子宫置于培养I中并进行冲洗。将冲出的液体在体视显微镜下进行观察，用移卵针捡出发育阶段和质量较好的胚胎进行实验，一般选用桑葚胚到囊胚期的胚胎。
1.2.6.3 显微注射
用嘴控移卵管转移胚胎至显微镜台上的注射操作室，固定住囊胚，将具有内细胞团(innercellmass,ICM)的胚胎放在6点或12点位置，瞄准后注射针快速准确地穿过透明带，慢慢地释放ES细胞进入囊胚腔，再慢慢抽出注射针。定期把注射过的胚胎转移到二氧化碳培养箱里，于M16培养基中培养。
1.2.6.4 胚胎移植
麻醉受体假孕母鼠,暴露受体雌鼠子宫，将注射ES细胞的胚胎吸人移卵针，在输卵管子宫结合部几毫米处避开血管开孔，将囊胚吹人子宫。术后将小鼠放置于干净的鼠笼里，用50 W的灯泡保温，并放在保温台上，直到其苏醒。
1.2.7 嵌合体小鼠的判定与交配
胚胎移植后21d左右小鼠产仔，10d左右可根据毛色显性判断其是否为嵌合体(chimera)以及嵌合率情况。将雄性嵌合体小鼠与C57BL/6J野生型小鼠交配，后代通过基因型鉴定，含有目的基因片段的杂合子小鼠为构建成功的Riok3条件基因打靶小鼠F1代。
2结果及分析
2.1原位杂交实验检测Riok3在小鼠卵巢中的表达
通过Riok3 mRNA基因编码序列的原位杂交实验，发现在P1、P3和P5小鼠的卵母细胞中Riok3均有特异性的表达。故推测Riok3基因可能参与小鼠卵泡的发育过程，进而参与卵巢发育。
2.2免疫组化实验检测Riok3在小鼠卵巢中的表达
对P1、P3和P5的小鼠卵巢进行Riok3抗体的免疫组化实验，结果显示，Riok3在出生后小鼠第1、第3和第5天的卵巢卵母细胞中都有明显信号，表明Riok3参与卵泡的发育过程，进而参与卵巢发育。
2.3 Riok3基因打靶的载体构建及基因打靶
将成功构建的Riok3条件基因打靶质粒线性化后，经胚胎干细胞的基因打靶，利用PCR方法筛选阳性重组克隆。同源臂鉴定PCR长度为3.9 kb ,5'同源臂鉴定的长度为5 kb，打靶载体构建。经琼脂糖凝胶电泳图显示，E号克隆为阳性克隆。
2.4 Riok3基因打靶小鼠模型构建
将得到的阳性干细胞进行囊胚显微注射、胚胎移植,得到嵌合体小鼠。本研究经胚胎移植的代孕母鼠共4只,最终得到3窝存活的嵌合体小鼠共12只。根据毛色挑选嵌合率较高的雄性嵌合体小鼠4只与C57BL/6J雌鼠进行交配，得到F1代小鼠。
收取其尾部组织，经过碱裂解法提取基因组DNA，通过琼脂糖凝胶电泳进行基因型鉴定。阳性条带大小为246bp，野生型条带大小为147 bp。Riok33 LoxP鉴定Forl:A GCTTTA GCGTCTGACTGG ; Riok33 LoxP鉴定Rev1 :TGAGTGCTTTTTTGAGTGTCC 。
实验结果显示2.3.6.78、9.10、13和16号为杂合子小鼠,其余均为野生型小鼠。
3讨论
蛋白激酶在体内信号转导中扮演着重要的角色,其中Riok3被发现在真核生物中参与细胞周期过程中核糖体的生物合成。Riok3 mRNA基因编码序列的原位杂交实验和Riok3抗体的免疫组化实验均发现Riok3在P1、P3和P5小鼠卵巢卵母细胞中高表达，表明Riok3可能参与小鼠卵母细胞的发育过程。
为此,本研究构建了Riok3条件基因打靶载体,通过基因打靶、干细胞囊胚注射和胚胎移植，得到了Riok3条件基因打靶的嵌合体小鼠。至此,成功构建Riok3条件基因打靶的小鼠模型( Riok3mrP/bou )。接下来可将Riolk3bxpP/bxP 基因型小鼠与在卵母细胞中特异性表达的GDF9-Cre基因型小鼠杂交，以获得卵母细胞中特异性敲除Riok3的突变型小鼠( Rio:30:/oxP/GDF9-Cre) ，进一步研究Riok3在卵母细胞发育中的功能，深入了解Riok3在卵巢发育过程中的分子调控机制。
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