进口宠物医疗器械的使用结果
来源：未知 |发布时间：2021-04-07 10:04|点击:次
实验方法
1.4.1基因鉴定.
(1) dtg小鼠子代DNA提取:①取材:麻醉后无菌状态下结扎并切取40d小鼠尾尖部0.4-0.6cm，置于已消毒且己标记1.5 mL离心管，操作后对创口进行消毒，必要时予以止血。②提取(天根DNA提取试剂盒):加200μLGA和18μL蛋白酶K并倒转混匀，置于恒温箱消化(56°C, 16- -18 h);简短离心2s,加200 μL GB并倒转混匀，简短离心3S;置于水浴箱(70 C,10 min)，简短离心3s; 加200 μL无水乙醇，振荡15s，简短离心3s;将溶液及絮状物转入带有收集管的吸附柱CB3，离心(12 000 r/min, 30s)， 弃废液;加500 μL GD，离心(12 000 r/min,30s)，弃废液;加600μL PW，离心(12 000 r/min，30s), 弃废液;重复上一步骤;离心(12 000 r/min, 2 min)，弃废液;开盖置于恒温箱(37 C, 3 min)，弃收集管,将吸附柱转入对应干净离心管中;加100μL TE，闭盖室温放置3 min，离心(12000r/min,2min)。置于-20C冰箱保存以用于后续实验。
(2)PCR:①tTA 和CCKR-2 PCR扩增体系: CCKR-2 及tTA反应体系总量为25μL，组成如下: DNA1 ul; Primer R0.1 ul;PrimerF 0.1 μL; 2xMasterMix 12.5 μL; dd H2O 9.5μL;纯水1.8μL;②PCR扩增条件:预变性(94 °C, 30s); 变性(94 °C,10s);退火(55 C，30s)，延申(72 C, 45s)， 重复35个循环; 4 C维持;③引物序列设计: CCKR-2(5'-3), F: ACGGTG GGA GGC CTA TAT AA，R: GAG TGT GAA GGG CAT GCA A;tTA(5'-3')，F: AGG CTT GAG ATC TGG CCA TAC, R: AGG AAAAGT GAG TAT GGT G。
(3)琼脂糖凝胶电泳:配制1.2%琼脂糖凝胶,加样: DNAMarker2μL，各PCR产物5μ;电泳: 140V， 125 mA，18 W,22 min;在紫外观测仪上观察电泳结果。
1.4.2组织学鉴定低温恒温器(Leica，CM-1900) 切取基因型鉴定符合的随机1只dtg小鼠子代及WT小鼠20μm大脑矢状切面。使用35S标记的寡核苷酸探针(β-球蛋白poly-A)进行原位杂交，具体方法如文献所述。
1.4.3寿命分析观察2 年内(104周)在自然状态下的每只实验小鼠从出生到其死亡的过程，记录出生和死亡日期以及生存到104周时的小鼠存活情况，绘制Kaplan-Meier生存曲线并分析结果。退出(在2年实验时间内因打架受伤死亡的小鼠)和终止(在2年实验的时间后仍然存活的小鼠)的数据为截尾数据。不明原因死亡且尸体解剖无明显疾病和外伤认定为小鼠自然死亡。
1.5 主要观察指标子代小鼠琼脂糖凝胶电泳条带位置、dtg小鼠和WT小鼠前脑区域杂交信号、实验时间内每只小鼠的出生日期、自然死亡日期、生存状态、意外死亡日期及原因。
1.6统计学分析以 SPSS 20.0软件进行数据分析，采用非参数估计法K-M法( Kaplan-Meier法)进行生存分析，用中位生存时间表示各比较组小鼠的生存时间，P<0.05时表示差异有显著性意义。
2结果
2.1实验动物数量分析截止到2年(104周)寿命观察时间点，各组动物的生存情况记录。
2.2dtg子代小鼠和WT小鼠PCR扩增产物电泳结果WT小鼠和dtg小鼠电泳条带见图1。dtg 小鼠显示位于550 bp和350bp位置的双条带。
2.3 dtg 小鼠和WT小鼠脑组织原位杂交检测结果。
WT小鼠前脑区域未见明显杂交信号(图2A)，在dtg小鼠包括大脑皮质、海马、纹状体等在内的前脑区域观察到强烈的杂交信号，而在中脑区域(丘脑/下丘脑)、后脑区域(脑干、脑桥、小脑)未观察到。
2.4雄性dtg小鼠和雄性WT小鼠生存情况及生存率结果比较实验观察至104周，雄性小鼠截尾数据情况。
雄性小鼠K-M生存曲线见图3。雄性dtg小鼠和雄性WT小鼠的生存率均随年龄增长逐渐降低，且雄性dtg小鼠生存率明显低于WT小鼠，雄性dtg小鼠中位生存时间为77周。两种小鼠生存率差异有显著性意义(x 2=35.280, P<0.001)。
2.5雌性dtg小鼠和雌性WT小鼠生存情况及生存率结果比较实验观察至104 周，雌性小鼠截尾数据情况见表3;雌性小鼠K-M生存曲线见图4。雌性dtg小鼠中位生存时间为76周，两组小鼠的生存率均随年龄增长逐渐降低，且雌性WT小鼠的生存率明显优于雌性dtg小鼠，两组小鼠生存时间差异有显著性意义(x2=56.231，P< 0.001)。
2.6雄性dtg小鼠和雌性WT小鼠生存情况及生存率结果比较实验观察至104周， 雄性dtg小鼠和雌性WT小鼠截尾数据情况及K-M生存曲线见图5。雄性dtg小鼠中位生存时间为77周;雄性dtg小鼠生存率明显低于雌性WT小鼠生存率，两种小鼠生存时间差异有显著性意(x2=48.550，P<0.001)。
2.7雌性dtg小鼠和雄性WT小鼠生存情况及生存率结果比较实验观察至104周，雌性dtg小鼠和雄性WT小鼠截尾数据情况及K-M生存曲线见图6。雌性dtg中位生存时间为76周。雌性WT小鼠的生存时间明显优于雄性dtg小鼠，且差异有显著性意义(x 2=41.563, P< 0.001)。
2.8 雄、雌dtg小鼠生存情况及生存率结果比较实验观察至104周，两种性别的dtg小鼠截尾数据情况及K-M生存曲线。dtg 小鼠雌性与雄性之间生存时间差异无显著性意义(x2=0.312，P-0.577)， 雄、雌dtg小鼠中位生存时间分别为76周和77周。
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