进口宠物医疗器械临床应用的结果
来源：未知 |发布时间：2021-04-06 10:07|点击:次
百草枯中毒致小鼠肺纤维化模型的建立
百草枯(PQ)是一种杂环类有机速效除草剂,广泛应用于农业,对人类和动物都有剧毒，致死率高达70%。在全球范围内,每年有250000 ~370 000人死于农药中毒 ,其中，因PQ中毒导致的死亡已经成为中毒患者的主要死因。这也成为一些国家尤其是发展中国家面临的一个重要公共卫生问题。
临床研究显示，中毒患者肺部PQ浓度是血浆中浓度的6~ 10倍,早期可表现为急性肺损伤及不同程度的急性呼吸窘迫综合征,肺泡细胞受损严重，肺组织过度修复。百草枯通过中性氨基酸转运蛋白到肺部,继而发生不可逆性和广泛性的肺纤维化，最终导致较高的死亡率。
目前,尚无有效的药物可以预防和治疗纤维化的进展,需要更多的临床和实验来探究中毒的机制。因此,本研究采用腹腔注射方式建立小鼠PQ中毒致肺纤维化模型,通过动物模型多方面评估其纤维化的表现,确定最佳的造模浓度,建立稳定的动物模型,为以后纤维化的机制研究打下基础。
1材料与方法.
1.1动物与试剂无特定病原体级别(SPF)的BALB/c小鼠(6~8周龄,雄性,18~22 g) 40只,由中国医科大学本溪研发中心实验动物部提供。在控制温度为22.2C的室内,将小鼠圈养在恒定的12h光照/12h黑暗循环环境中。这些实验经中国医科大学动物实验伦理委员会批准(许可编号:2017PSPSK)。百草枯粉剂,抗a-SMA抗体和E-cadherin抗体。
1.2动物分组 和处理方法PQ中毒的小鼠模型建立。腹腔注射方式染毒,方法:A组为生理盐水空白对照组;B组10 mg/kg 单次染毒;C组20 mg/kg单次染毒;D组10 mg/kg隔日1次染毒。共3次。D组首次染毒后至第21天,用10%水合氯醛腹腔注射麻醉处死小鼠,取双肺组织。
1.3苏木精 -伊红染色( Hematoxylin-eosin, HE染色)、马松(Masson 染色)染色将小鼠整个左肺组织用4%福尔马林固定过夜。在70%乙醇中常规脱水,并在二甲苯中澄清,制备4 μm切片用于常规梯度酒精脱水、浸蜡、包埋、切片,HE染色镜下评估肺组织病理学变化和Masson染色，用于证明胶原沉积。
1.4 Ashcroft评分用Ashcroft 半定量评分来评估小鼠肺组织纤维化程度。具体评分标准:0级,正常组织;1级,支气管壁轻度增厚;2 ~3级，纤维化程度加重,支气管肺泡壁中度增厚;4 ~5级,重度纤维化改变,支气管壁结构破坏,有纤维条索或纤维团块形成;6~7级,极重度纤维化,大范围肺组织结构破坏,可伴有蜂窝肺形成;8级,满布纤维组织，整个肺组织全部闭塞坏死。
1.5Westermblot蛋白检测取小鼠右肺组织剪碎成小块称重，放人EP管中。用提前预冷的含有蛋白酶抑制剂(PMSF)的蛋白质抽提试剂在冰上裂解肺组织后于14 000 g离心，取上清液转移入新的EP管中。用BCA法测定提取的上机检测蛋白浓度。取50 g总蛋白上样，经10% SDS-PAGE凝胶电泳分离,再转移到硝酸纤维素膜上,用5%脱脂奶粉室温封闭1 h, 加入一抗孵育4 C过夜。
辣根过氧化酶标记的二抗室温孵育1 h,上机扫描检测拍照。每组实验至少重复3次。
1.6观察指标一般情况检测:小鼠精神状态、体重、毛发、呼吸频率、进食水量及异常行为(激惹)和小鼠的生存分析,肺组织HE染色，Masson三色染色, ax-SMA和E-cadherin蛋白检测。
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