不同人工骨修复兔桡骨骨缺损的实验
来源： |发布时间：2022-12-19 10:32|点击:次
慢病毒包装及滴度测定
取长势良好、对数期生长的293T细胞，37℃、5%CO 2饱和湿度条件下接种、孵育。取HIF⁃1α质粒10μl，按Lenti⁃Pac HIV表达包装试剂盒步骤操作。
48 h后收集培养基，离心除去细胞杂质碎片，即获得包含慢病毒载体颗粒的培养基溶液。
采用PEG法浓缩病毒颗粒，并测定病毒滴度，病毒滴度=感染细胞数×GFP阳性率×病毒稀释倍数/病毒量。
四、HIF⁃1α慢病毒质粒转染兔BMSCs
（1）取生长状况良好、处于对数生长期的BM⁃SCs，消化，反复吹打制成细胞悬液。
（2）将细胞悬液接种在6孔板中，调整每孔细胞数约为5×10 4个，置于37℃、5%CO 2细胞培养箱中培养；待细胞融合度约为85%时进行下一步操作。
（3）用24孔板预实验，设置MOI值（病毒与需要感染的细胞数的比值）分别为1、2、5、10、20、50、100的7个感染组，确定最佳MOI值为50 TU/cell。
（4）根据病毒滴度配置相应浓度的病毒稀释液和对照eGFP的病毒稀释液。
（5）转染前吸弃各组培养液，PBS清洗1次。实验组中加入2 ml病毒稀释液，对照组中加入2 mleGFP病毒稀释液，空白组中加入2 ml培养液，常规培养孵育48 h。
（6）倒置荧光显微镜下观察细胞转染情况。
五、复合人工骨材料制备
（1）将nano⁃HA人工骨材料大小裁剪为8 mm×3 mm×3 mm大小，在75%乙醇内浸泡30 min，PBS中浸泡1 h，上述过程重复3次，紫外线下照射1 h。
（2）将消毒后的nano⁃HA浸润在含兔BMSCs培养基的6孔板内24 h，以充分湿润材料表面及内部。
（3）取转染HIF⁃1α后的BMSCs，消化，离心，沉淀，用培养基重悬细胞，将细胞浓度调整至1×10 5个/ml，接种到6孔板中已润湿的nano⁃HA材料表面。
置于细胞培养箱中培养2 h后将材料翻面再次接种细胞，每次接种时nano⁃HA材料要求被细胞悬液浸透。置于培养箱中继续培养，制备得到HIF⁃1α⁃eGFP/BMSCs/nano⁃HA复合人工骨。
（4）同理，将未转染HIF⁃1α的BMSCs种植到na⁃no⁃HA表面，得到BMSCs/nano⁃HA复合人工骨。
六、不同人工骨修复兔桡骨骨缺损
采用随机数字表法将30只健康2月龄新西兰大白兔平均分为3组（实验组、对照组和空白组）。
所有实验兔于实验前禁食8 h，经耳缘静脉缓慢注射3%戊巴比妥钠（1 ml/kg）行全身麻醉。在无菌手术台上常规固定实验兔，备皮消毒和铺巾，分别取其双耳桡侧皮肤表面中段作1.5 cm纵行切口，仔细分离皮下组织，充分暴露桡骨干。于中段用线锯截骨后制成1.0 cm桡骨骨缺损模型，实验组植入HIF⁃1α⁃eGFP/BMSCs/nano⁃HA复合人工骨，对照组植入BMSCs/nano⁃HA复合人工骨，空白组不植入。予生理盐水反复冲洗术区，彻底止血，肌肉组织包埋，逐层缝合创口，加压包扎无菌敷料。麻醉清醒后分组放入兔笼，单笼饲养，自由活动。术后对所有实验兔肌注双抗，2×10 5 U/次，1次/d，共3 d。无菌饲料室温喂养，洁净饮水，自由活动。
观察各组实验兔术后的饮食、活动、步态及伤口感染、愈合情况，于术后12周取标本时观察植入材料表面情况、骨缺损处的骨痂形成、断端髓腔再通情况。术后4、8、12周分别对所有实验兔的手术部位进行X线检查，观察材料吸收和骨愈合情况。于术后12周，用空气栓塞法处死实验兔，手术取出双侧桡骨标本。截取骨缺损修复处及上下缘约5 mm正常桡骨组织，福尔马林固定，依次进行脱钙、脱水、透明、包埋等常规骨质切片处理，每组5个样本，HE染色，观察关节骨缺损处骨痂形成及骨材料降解情况。
