小鼠发情周期阴道上皮细胞形态变化的研究
来源：未知 |发布时间：2021-11-19 13:46|点击:次
小鼠发情周期阴道上皮细胞形态变化的研究
小鼠是常用的医学实验动物，发情周期一般为5～6d，根据其生理变化，可将发情周期划分为4个时期，即发情前期、发情期、发情后期和发情间期。啮齿类动物在性周期的不同阶段，阴道黏膜发生不同程度的变化，因此可一次判断发情周期的不同阶段。为了确定、区分小鼠各个发情阶段，本实验采用阴道组织涂片法，对己烯雌酚处理的小鼠，在发情周期各阶段分别进行阴道组织涂片观察，以期探究小鼠发情周期阴道内部细胞组织发育变化及形态特征，为区分小鼠发情周期阶段提供数据参考。
1材料与方法
1.1实验动物
以6只雌性未孕小白鼠为实验动物，在室温、自然光照、自由饮水的条件下合笼饲养，采用全价颗粒饲料饲养。
1.2实验器材与药品
显微镜、10μL移液枪、1mL注射器、鼠笼、苏木精伊红染液、生理盐水、己烯雌酚等。
1.3方法与步骤
1.3.1诱导发情
取雌性小鼠4只，其中2只作对照，其余每只皮下注射己烯雌酚50μg。待实验鼠外阴部出现发情症状后，每天7:00时、15:00时、23:00时进行阴道黏液涂片直到发情间期。整个实验大约持续6d。
1.3.2阴道黏液涂片的制作
用右手小拇指和无名指夹住小鼠尾根，手背压过小鼠背部，再用大拇指和食指握紧小鼠颈部背侧和耳部的皮肤以完成小鼠的固定工作。移液枪插紧枪头，吸取10μL生理盐水，打入小鼠阴道内部，并来回抽吸数次，充分混匀后滴到载玻片中央，均匀涂开，在空气中自然干燥。然后将干燥好的载玻片放到95%酒精里固定15min，苏木精染色15～30min，自来水冲洗2min，伊红染色1min，蒸馏水冲洗干净剩余染料，封片镜检。
2实验结果
发情前期是发情间期向发情期的过渡，阴道涂片的特征为形状不规则或蝌蚪状的有核上皮细胞占绝大多数，白细胞和角质化上皮细胞很少;发情期阴道涂片的特征几乎全是片状的，无核角质化细胞;发情后期是发情期向发情间期的过渡，阴道涂片特征为少量无核角质化上皮细胞，白细胞占大多数;发情间期阴道涂片特征为上皮细胞少而皱缩，涂片中有大量白细胞。
3讨论
小鼠阴道黏膜为复层扁平上皮，又称为复层鳞状上皮，由不同层数的细胞所组成，其细胞形状由底部的立方状逐渐转变成表面的扁平状。基底细胞可持续分裂，新形成的细胞会逐渐推向游离表面，之后便会脱落。在此过程中，细胞会先成熟然后再退化，表面细胞会有明显的退化;这在核方面特别明显，它们会逐渐变得致密、扁平，之后完全瓦解。
因此小鼠的发情周期是一个连续变化的周期性过程，所以各阶段阴道脱落的细胞组成内容也是逐渐转变的，这在本实验中发情期频繁采样观察的结果中得到很好的体现。在发情前期，己烯雌酚未完全吸收入血，小鼠血液的己烯雌酚水平还未达到顶峰，阴道上皮细胞发育或成熟速度缓慢，脱落的上皮细胞仍以有核上皮细胞为主。
当处于发情期时，体内的己烯雌酚水平达到最大，己烯雌酚刺激阴道上皮增厚，上皮细胞迅速生长发育，表面的细胞变得大而扁平，呈多边形，有钝角，成熟后退化，细胞核逐渐消失，此时上皮细胞合成和聚集的大量糖原会在阴道杆菌的作用下分解成乳酸，使阴道保持酸性，抑制病菌的生长繁殖。
随着己烯雌酚水平慢慢下降，上皮细胞的发育速度慢慢趋向正常，上皮变薄，在脱落掉剩余的发情期时过度成熟的无核上皮细胞后发生白细胞浸润，防止由于糖原减少引起微生物感染，所以此时白细胞是此时阴道涂片主要的细胞成分，但仍有部分或较少的无核上皮细胞。
虽然阴道涂片法可以较明显地区分小鼠发情周期各阶段特征，但当实验鼠出现个别发情不明显或个别发情阶段特征不明显的现象时，在各阶段阴道脱落的细胞组成成分差别不大，比如本实验中发情间期和发情后期的镜检结果，该方法便表现出一定的局限性，需要进一步通过其他方法来确认是否发情。在本实验中影响实验结果相关的实验设计及实验操作方面因素及注意事项有:
3.1实验安排
小鼠的发情周期不同于大鼠，发情周期内各阶段持续的时间也与大鼠有异，而且考虑到实验鼠数量有限，可能存在的个体差异大的问题会影响实验数据的准确性，因此实验并没有完全按照资料上提供的数据安排小鼠阴道黏液采样时间，而是根据每次涂片制作后的镜检结果来决定下次采样时间。尽管小鼠的发情周期约为5～6d，但阴道黏液变化最为明显的时间则集中在前3天时间内，所以本实验在前3天内的采样次数比较集中，即每天3次采样，后3天采样则没有如此频繁，一天一采即可。
3.2采样
每次采样时，小鼠阴道内壁柔嫩，用枪头吸取黏液时动作要轻柔，避免动作过大划伤小鼠阴道，影响实验结果观察。
考虑到每次采样对小鼠是强应激刺激，势必会影响实验结果的准确性。因此，本实验将实验鼠分两批采样，有两只实验鼠在发情前期发情期时制作涂片，另外两只鼠在发情后期时制作涂片，而当4只实验鼠处于发情间期时，均制作涂片。
3.3涂片制作
因不同阶段细胞组成成分不同，要保证细胞核充分染色，所以苏木精染色时间较长。另外，15min的染色时间并不固定，要根据染色效果实时调整。
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