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来源：未知 |发布时间：2021-06-08 09:11|点击:次
脂肪间充质干细胞治疗系统性硬化症模型小鼠的机制
系统性硬化症是一种以皮肤和内脏器官纤维化、免疫异常、血管病变及胶原蛋白沉积为特征的结缔组织病。目前，系统性硬化症的发病机制仍不清楚，传统的治疗手段如糖皮质激素及免疫抑制剂等无法治愈该病，并且带来感染、骨质疏松等许多不良反应，因此临床急需能够治疗系统性硬化症的创新疗法。
研究发现Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅴ型胶原蛋白是导致系统性硬化症纤维化的主要成分，而转化生长因子β、白细胞介素17、白细胞介素6及肿瘤坏死因子α等细胞因子与胶原蛋白的表达密切相关。间充质干细胞由于其来源广泛、分化潜力大、免疫原性低以及不良反应少等特点，被证明在多种自身免疫性疾病中具有治疗作用。已有研究证实间充质干细胞可以促进皮肤创面的修复。脂肪间充质干细胞(adipose-derivedstemcells，ADSCs)作为间充质干细胞的一员，取材方便、培养简单，具有多向分化潜能的特性使其可以应用于移植治疗。
最近的临床研究发现，自体脂肪间充质干细胞可以有效减轻辐射诱导的系统性硬化症患者面部的纤维化，但其作用机制不明。该研究利用脂肪间充质干细胞治疗博莱霉素诱导的系统性硬化症模型小鼠，观察脂肪间充质干细胞的治疗效果，以期为系统性硬化症的治疗提供新的思路。
1材料和方法Materialsandmethods
1.1设计随机对照动物实验。
1.2时间及地点2018年9月至2019年8月在包头医学院第一附属医院风湿免疫科(包头医学院风湿免疫研究所)，内蒙古自治区自体免疫学重点实验室完成。
1.3材料
1.3.1实验动物SPF级6-8周龄C57BL/6J雌性小鼠80只，体质量20g左右，购于上海轩研生物科技有限公司。
1.3.2实验试剂及仪器博来霉素；DMEM/F12、胎牛血清、PBS、DPBS；碱性磷酸酶测定试剂盒；茜素红及油红O测定试剂盒；鼠抗人CD105-FITC、CD90-FITC、CD44-PE、CD34-PE、CD11c-PE、CD45-FITC单抗；酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒；抗CD31(ab9498)、抗胶原蛋白Ⅰ(ab34710)、抗胶原蛋白Ⅲ(ab7778)和抗胶原蛋白Ⅴ(ab7046)、山羊抗兔IgG(ab150083)；Hoechst33258；细胞培养箱；倒置相差显微镜；流式细胞仪。
1.4实验方法
1.4.1脂肪间充质干细胞的分离培养40只雌性小鼠行颈椎脱位安乐死并在体积分数为75%乙醇中消毒30min。取腹股沟的皮下脂肪组织，PBS洗涤3次，无菌组织剪将组织剪碎，置于Ⅰ型胶原酶中37℃消化30min，70μm过滤器纯化后将滤液以1600r/min离心5min，将细胞沉淀重悬于含体积分数为10%胎牛血清和1%双抗的DMEM/F12培养基中，置于37℃、体积分数为5%CO2培养箱内培养，每三四天换液1次，当细胞长至90%融合时进行传代培养，取第3代脂肪间充质干细胞用于后续实验。
1.4.2脂肪间充质干细胞诱导分化检测取60%-70%融合的第3代脂肪间充质干细胞，更换成骨诱导分化培养液及成脂诱导分化培养液，每3d换液1次，培养21d后移除培养基，PBS润洗2次后进行以下检测。
①碱性磷酸酶染色：加入孵育液37℃孵育15min，硫酸钴溶液处理一两分钟，流水冲洗后1mLPBS覆盖细胞，显微镜下观察，碱性磷酸酶活性处呈黑色或棕黑色；②茜素红染色法：用茜素红S染色液滴染2min，稍水洗后McGee-Russell分化液迅速分化数秒，Mayer苏木精染色液浅染胞核2min，PBS浸洗3次，1mLPBS覆盖细胞，显微镜下观察可见细胞内出现红色的矿化结界；③油红O染色：加入OROFixative固定液固定，蒸馏水洗2次，60%异丙醇浸洗，加入配好的OROStain，弃去染色液，水洗3次，加入Mayer苏木精染色液染核2min，加入OROBuffer1min后弃去，1mLPBS覆盖细胞并在显微镜下观察，诱导后的细胞胞浆中可见红色的油滴。
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