兔子解剖器械实验材料与方法
来源：未知 |发布时间：2021-05-18 15:27|点击:次
兔子解剖器械实验材料与方法
1.1材料
1.1. 1实验动物
16只6周龄SPF级雌性BALB/c兔子，体重约18~20g,购自西安交通大学医学实验动物实验中心[ SCXK(陕)2018-001] ,饲养于西安交通大学医学实验动物中心[ SYXK(陕)2015-002] ,所有操作均符合西安交通大学医学部生物科研伦理要求(审批号:IACUC 2015036)。
12只3周岁普通级雌性猕猴,体重约3.8 ~4.0kg,购于中国科学院昆明动物研究所[SCXK.(滇)2017-0003],饲养于空军医科大学实验动物中心[ SYXK(陕)2019-001]。单笼饲养,饲养室温度控制在24 ~ 26°C ,相对湿度控制于40% ~ 60%,自由活动。所有操作均符合陕西省林业厅生物科研伦理要求(审批号:IACUC 2011065)。整体实验过程符合3R原则。兔子解剖器械。
1.1.2 试剂与仪器
表达TSHRA亚单位的重组腺病毒(A-sub-Ad),对照病毒( con-Ad),碘-甲状腺素放射免疫分析药盒 ,TRAb滴度ELISA法检测 , Treg细胞检测试剂盒。正置光学显微镜,流式.细胞仪( BD, FACSCalibur）
1.2方法
1.2.1动物分组及诱导GD动物模型
兔子随机分为造模组和对照组,采取国际公认的腺病毒造模方案 ,造模组用表达TSHR A亚单位的重组腺病毒进行免疫(A-sub-Ad),对照组用对照病毒进行免疫( con-Ad)。兔子解剖器械造模组用PBS稀释病毒原液,取50μL病毒稀释液经股四头肌肌肉注射。每只兔子每次注射剂量为1 x 10。vp,每三周免疫1次,共3次,于末次免疫后四周安乐死兔子。猕猴随机分为造模组和对照组,造模组用PBS稀释病毒原液，取1mL病毒稀释液经两侧股四头肌肌肉注射,每侧500μL。猕猴组的病毒用量是基于兔子剂量通过体重和体表面积换算出的,每三周注射1次,共5次,于末次免疫后四周安乐死猕猴。取兔子解剖器械和猕猴的外周血、甲状腺、脾等组织测定T4、TRAb及免疫学相关指标。
1.2.2 甲状腺激素、TRAb测定
血清总甲状腺素TT4水平由放射免疫法检测:含T4的血清和125I标记的T4与相应的抗体反应后形成抗原抗体复合物。加入二抗和聚乙二醇,使免疫复合物沉淀并离心，使用γ计数器测定沉淀物放射性强度。最后通过标准曲线得到血清中T4最终浓度。
TRAb滴度ELISA法检测:含TRAb的血清加入包被着TSHR蛋白的ELISA板进行孵育，随后加入M22单克隆抗体与TRAb竞争性结合TSHR。加入二抗和辣根过氧化物酶,用四甲基联苯胺进行显色,使用酶标仪测定其OD值。最后通过标准曲线得到血清中TRAb最终浓度。兔子解剖器械。
1.2.3甲状腺病理
甲状腺组织用10%甲醛固定，石蜡包埋切片，HE染色,光镜下观察其组织病理学改变。
1.2.4流式细胞测定
使用流式染色缓冲液将脾或外周血单个核细胞重悬至每毫升5 x 10个。Treg 细胞染色按照商品说明书进行,首先使用FITC标记的CD4和APC标记的CD25进行表面染色,固定破膜后使用PE标记的Foxp3进行核内染色。最后使用多通道流式细胞仪进行检测, Cell Quest软件进行数据分析。
1.3统计学分析
使用SPSS 24. 0软件进行统计学检验。计量资料数据形式为平均值土标准误(x土sx)。兔子解剖器械两组间比较采用独立样本t检验,检验标准以P< 0.05表示差异具有显著性。
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