土鳖虫活性肱对急性血瘀实验大鼠的影响
来源：未知 |发布时间：2021-03-09 09:49|点击:次
土鳖虫活性肱对急性血瘀模型大鼠的影响
(1）急性血瘀大鼠造模及给药:根据文献[21]修改如下,90只雄性SD大鼠适应性饲养了d后随机分为5组,即空白组﹑模型组,尿激酶阳性组、土鳖活性肽组分F2高剂量组。土鳖活性组分F2低剂量组。除空白组以外，其他组大鼠每天定量给予50 g高脂饲料和4.0 mL高脂乳剂,空白组大鼠给予普通饲料,持续45d。同时,用高脂饲料和高脂乳剂饲养15d 后,每只老鼠肌肉注射0.2 ml.盐酸肾上腺素注射液(除空白组)。注射3o min后冷水浴(4 ℃)15 min,持续30d造模。按照体表面积方法计算,尿激酶组给药剂量1.0×10”U/kg 土鳖活性肽组分F2高.低剂量组按照预试验结果确定的给药浓度分别为50.25 mg/kg,模型组和空白组给予生理盐水。所有样品均用生理盐水溶解,肌内注射给药15d,给药期间持续给予高脂饲料。
(2)血液取样:末次给药5h后,于大鼠腹主动脉取血3.0 mL.,注人肝素钠的玻璃硅化管内,离心取血浆;同时取5.0 ml.血液注入未加人抗凝剂的EP管,离心取血清。
(3》生化指标测定:采用全血液自动分析仪.血流变分析仪对各组大鼠血浆进行血液流变指标检测,并测定血清中 HDL/LDL、TG、T-CHO、sOD、NO、t-PA和 FIB的含量。
1.4数据统计与分析
所有数据采用SPsS 20.0和Graphpad Prism进行处理,试验数据为3个平行样品的平均值,以 Mean士SD表示,LSD检验两两比较;若方差不齐,检验其差异性则采用H-G检验。
2结果与分析
2.1纤溶活性测定标准曲线
以溶圈面积为纵坐标,尿激酵活力的对数为横坐标得到的线性方程为￥一1.564X—1.863 5,R日 —0.9972,线性范围为1.3376—一5.987 1 cmR。
2.2土鳖活性肽分离纯化
2.2.1 超滤和纳滤分离的活性肽超滤试验结果表明分子量>3 kDa 活性肽溶液无纤溶活性,而分子量<3 kDa活性肽溶液具有明显活性,因此对分子量<3 kDa活性肽溶液进行纳滤分离。分子量1一3 kDa活性肽溶液和分子量<1 kDa活性肽溶液均有纤溶活性,但是分子量1一3 kDa活性肽溶液纤溶活性更强，对结果进行分析得出:<1 kDa活性肽溶液多为游离氨基酸,氨基酸并不能直接发挥活性作用,面>3 kDa活性肽溶液多为灭活后残留的胰蛋白酶、胃蛋白酵,几乎没有活性。1一3 kDa活性肽溶液多为活性肽集中存在区域,故选定该分子质量范围的醇解液进行分离纯化。
2.2.2 DA201-C型吸附树脂.葡聚糖凝胶G-25和 RP-HPLC分离的活性肽DA201-己型吸附树脂处理后的去离子水洗脱液纤溶活性为0,可直接舍弃;其他3个洗脱组分的纤溶活性顺序为50%乙醇洗脱液(13 159.89 U/g)>25%乙醇洗脱液(4 107.95 U/g)>75%乙醇洗脱液(515.87 U/g)。说明DA201-C树脂分离的活性较强的肽多为中等极性。
然后采用葡聚糖凝胶G-25对50%乙醇洗脱液进行分离纯化﹐获得的P1.P2和P3洗脱峰的纤溶活性分别为1674.33.62 044.61.8 615.63 U/g,因此选定活性最强的P2洗脱组分继续分离纯化。,经过RP-HPLC色谱柱分离后,可获得5个色谱峰(F1一F5)。其中,F2的纤溶活性(167 808.97 U/g)远大于其他峰,故选择土鳖虫生物活性肽F2进行药理试验。2.3土整虫活性肽组分F2对急性血瘀模型大鼠影响
2.3.1血细胞、血液流变指标如表2所示,尿激酶组大鼠红细胞压积、血小板计数明显降低,并与模型组比较具有显著性差异,说明尿激酶可以明显改善血液流动。土鳖虫活性肽组分F2高.低剂量组也具有使两项指标降低的作用,其中高剂量组与模型组差异显著(P之0.05)。血流变试验结果分析得出,尿激酶组对其改善效果较佳且与模型组比较具有极显著性差异(P<0.01)-土整虫活性肽组分F2高。
低剂量组均能降低急性“血瘀证”大鼠在高、中、低切度下的血流变值,且与模型组相比具有极显著性差异(P之0.01),说明土鳌虫活性肱组分F2具有改善急性“血瘀证”大鼠的血液流变指标的作用。土鳌虫活性肽组分F2高、低剂量组除低切下具有差异外,其他切度下没有显著性差异,说明治疗效果和剂量间没有关系。
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