进口宠物医疗器械的产品哪家好？
来源：未知 |发布时间：2021-03-27 09:38|点击:次
实验兔基因型检测:取实验兔直径约5 mm的耳组织，加入300 μL 8 mmol/L NaOH,置于95 C金属浴,30 min后取出，冷却至室温,加入30 u pH 7.5 Tris-HCl, 12 000 r/min, 4 C离心10 min。PCR扩增体系(10μL): 2x Taq Mix 5μL，引物各0.5μL,模板0.5μL。采取扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳，根据条带大小来鉴定实验兔基因型。
1.3.3实验兔HuR蛋白水平检测:取成年实验兔新鲜肝脏，经液氮快速冷冻后碾磨成粉,取适量加入强RIPA试剂( 50 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0、150 mmol/LNaCl、1% Triton X-100、1%脱氧胆酸钠、0.1% SDS,并在使用前加入1 mmol/L PMSF, 1 x蛋白酶抑制剂混合液(PIC), 0.5 mol/L蔗糖,冰上裂解30 min。
12 000 r/min, 4 C离心10 min。取裂解液上清,经BCA法测定蛋白浓度，加入5 x SDS-PAGE LoadingBuffer, 95 C 5 min变性。样品经100 V、SDS-PAGE凝胶电泳2 h, 200 mA湿转2 h至PVDF膜上。后经5%脱脂奶粉封闭，分别以鼠抗HuR mAb、鼠抗VinculinmAb(1:1 000) 为一抗，以Goat anti mouse IgG HRP(1:5 000)为二抗,加入显影剂,拍照显影。
1.3.4 实验兔肝脏免疫荧光实验:手术取HuR/Alb-Cre和HuR实验兔肝脏，取10μm厚度进行冰冻切片。经55 C烘干，4% PFA固定15 min。PBS清洗3次，每次5 min。0.1% Triton X-100/PBS,室温下通透30 min。PBS清洗3次,每次5 min。封闭液: 1%羊血清+ 2% BSA/PBS室温封闭30 min。封闭液稀释-抗鼠抗HuR mAb(1:100 )和一抗兔抗HNF-4a( Hepatocyte unclear factor 4a, HNF-4a,肝细胞核因子4a)mAb(1:100),室温孵育2 hPBS清洗3次,每次5 min。PBS稀释荧光二抗(1:500),山羊抗鼠-488和山羊抗兔-594,室温孵育30 min。PBS清洗3次，每次5 min。在荧光显微镜下拍照保存。
1.3.5 实验兔肝脏石蜡切片及HE染色:手术取HuR"n/Alb-Cre和HuR实验兔肝脏，经4% PFA,固定过夜。次日流水冲洗24 h。经酒精梯度脱水，二甲苯梯度透明净蜡,包埋后经取10 um切片。切片经甲苯梯度复水。苏木精液染色5 min。流水冲洗5 min。1%盐酸乙醇分化30s,蒸馏水洗30 S。0.5%伊红液染色5min,蒸馏水洗30 s。经酒精梯度脱水，二甲苯透明中性树胶封固,拍照保存。
1.3.6高脂喂养后实验兔血脂和肝功能检测:取雄性6周龄HuR/Alb-Cre和HuR各6只,单笼高脂喂养18周，称取体重后禁食6 h。异氟烷吸人麻醉后开腹下腔静脉取血,室温放置1h,待血液自然凝固后经4C、1 000 g离心10 min分离血清,检测AST、ALT. TG、HDL-C、LDL-C、血糖。
1.4 统计学分析
采用Graphpad prism 7软件对数据进行统计分析,比较两组样本的均值,每组样本量为6个，均采用独立样本t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。蛋白免疫印迹、免疫荧光、HE染色等实验最少重复3次。蛋白条带灰度值由Image J软件读取，经Excel 2019编制公式运算获得其与内参条带灰度值的比值。
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