小鼠固定器实验所需材料
来源：未知 |发布时间：2021-05-10 10:50|点击:次
1材料方法
1．1实验试剂及材料
pcDNA3、pcDNA3．CZP3由本实验室保存及构建。6～8周龄12只BALB／c小鼠固定器，生产许可证号：SCXK(京)2016-0011，购自北京维通利华，比格犬卵巢由新疆医学院科技楼惠赠。CZP3c重组蛋白为本实验室纯化并保存。HRP标记的山羊抗小鼠二抗、FICT标记的兔抗鼠二抗、BSA，孕马血清(PMSG)、人绒毛促性腺激素(hCG)，透明质酸酶。其他化学试剂均为国产分析纯。
1．2质粒的提取、纯化及定量按《分子生物学实验技术》中的实验步骤，对pcDNA3、pcDNA3-CZP3进行质粒的提取及纯化。用紫外分光光度仪定量灭菌生理盐水溶解纯化后的质粒，使其终浓度为1g止。
1.3小鼠免疫
12只BALB／c雌性小鼠固定器随机分为2组(n=6)：实验组和阴性对照组，第0、2、4周分别向每只小鼠腿部肌肉注射50LpcDNA3一CZP3和pcD—NA3质粒，然后迅速进行6次电脉冲(电压30V)刺激。初免后，每周从小鼠眼眶静脉丛取血，分离血清，一80℃备用。
1.4ELISA检测抗体水平用纯化后的CZP3c重组蛋白作为包被抗原，浓度为10斗g·mL～。血清的稀释倍数为1：100，山羊抗小鼠二抗的稀释倍数为1：2000，OD帖。检测抗体水平。
1.5抗体滴度检测
选择抗体水平最高的第6周血清进行倍比稀释，血清按照1：50、1：500、1：1000、1：1200、1：4000进行稀释，ELISA检测各组的抗体滴度。
1.6小鼠固定器卵子的间接免疫荧光取5只BALB／c雌性小鼠进行超数排卵实验。
每只小鼠肌肉注射12Iu的PMSG，46h后肌肉注射12Iu的hCG。13h后处死小鼠，收集壶腹部卵子。用5IU的透明质酸酶室温消化5min后，将卵子转移至BMOC培养基制作的液滴中。磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗卵子数次后，计数，将卵细胞平均分为2组放置于防脱载玻片上。无水乙醇固定后，5％BSA，37℃，5％C02培养箱中封闭1h。PBS冲洗3次后，加入一抗(稀释倍数为1：50)，37oC，5％CO：培养箱中孵育1h。PBS冲洗3次后，加入FITC标记的兔抗鼠二抗(1：200)，37℃，5％CO：培养箱中孵育30min。PBS充分清洗，甘油封片后于荧光显微镜下观察结果。
1.7犬卵巢切片的间接免疫荧光比格犬卵巢固定后委托新疆医学院科技楼病理切片室制作成5¨m厚切片。56℃烤片1h后，乙醇脱蜡，柠檬酸盐微波加热修复抗原10min。切片温度降至室温后，用PBST清洗。用含有2％兔血清的PBS37℃孵育封闭1h。一抗(1：50)4℃孵育过夜。PBST清洗切片后，加入FITC标记的兔抗鼠二抗(1：200)，37℃孵育30min。充分清洗后用甘油封片于荧光显微镜下观察结果。
1．8避孕效果检测
初免后第6周，对每组小鼠固定器进行分笼，每笼3只小鼠。同时每笼放人1只具有生殖能力的雄鼠进行合笼实验。雄鼠每天轮换1次，3周后取出，计算雌鼠的产仔数及生育率。
1．9组织学分析
第24周处死小鼠，取出卵巢用4％多聚甲醛固定24h。卵巢经脱水、包埋后，制成2张5um厚的连续切片。切片经HE染色后于显微镜下观察结果。
1．10统计学分析
数据利用Prism5进行分析，其中，抗体水平、抗体滴度用t检验、产仔数用z2检验、抗体水平与产仔数关系用Spearman相关性分析。小鼠固定器的抗体水平、抗体滴度和平均产仔数均用i±s表示。当P<0．05时，差异具有统计学意义。
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