小鼠固定器，小鼠固定架的使用方法
来源：未知 |发布时间：2021-04-02 09:50|点击:次
超声引导下左心室内注射人肺癌细胞建立骨转移小鼠模型
肺癌是世界范围内导致患者死亡的主要原因之一。
尽管目前对肺癌的早期诊断和临床治疗较以前有了长足进步，但不容忽视的是肺癌患者大多在中晚期才被确诊，5 年生存率不足15%，且90%以上肺癌患者死于转移。
骨转移是肺癌患者死亡的主要原因之一，由于骨质和骨膜破坏，常造成局部疼痛、骨和关节运动障碍、病理性骨折、高钙血症和神经压迫等症状，从而导致患者生活质量明显下降。
目前，肺癌骨转移的发生和发展机制尚不清楚，是肺癌研究领域或需解决的关键问题之一。制作可靠的动物模型是肿瘤机制研究的重要基础，但目前国内外有关肺癌骨转移的动物模型鲜有报道。
本项目通过在超声引导下心内注射肺癌细胞，建立一个可靠的肺癌骨转移小鼠模型，以期为肺癌骨转移的临床诊治和基础研究提供新的实验工具。
1材料与方法.
1.1材料
1.1.1 人肺癌细胞株人肺癌细胞A549和NCIH1299来源于癌基因及相关基因国家重点实验室，由本实验室常规保存。细胞分别用含有10%
胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的RPMI 1640和DMEM培养液，置于37C、5% CO2的培养箱内进行培养。
1.1.2实验动物6~8 周龄雌性NOD/SCID小鼠和BALB/c-nu/nu小鼠，各8只，由上海市肿瘤研究所提供[SCXK(沪)2017-0009]。动物实验及
饲养严格遵守国家相关标准要求[SYXK(沪)2017-0011]。
1.1.3仪器和试剂小动物高分辨超声成像系统。
小动物活体荧光成像系统型号为LB983(NC320)，分析软件为WinLight32。小动物MicroCT，型号为Skyscan1076。荧光显微镜。荧光素酶(uciferase, Luc)。RPMI 1640和DMEM培养液。胎牛血清。培养皿及培养板。D-Luciferin 底物(货号ab143654)。
1.2 方法
1.2.1人肺癌细胞转染将 A549和NCI-H1299细胞按60 %~70 %的细胞密度铺于6孔培养板，第2天加入绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)/Luc双标的病毒(由德国癌症研究中心的Haemmerling GJ博士惠赠)进行感染41, 6~8 h后换液，进行常规培养。待细胞扩增后，荧光显微镜下观察GFP表达情况，若标记的细胞中GFP表达较弱或细胞标记率不能达到90%时需进行流式细胞术分选。
1.2.2 超声引导下心内注射人肺癌细胞骨转移小鼠模型的建立取 GFP/Luc标记的处于对数生长期的人肺癌细胞A549,用不含血清的RPMI 1640培养液调整细胞密度为1.5X 107/mL, 用1 mL胰岛素注射器(29G，BD Bioscience)吸取0.2 mL细胞悬液(含细胞数3 X 106个)备用。
用1%戊巴比妥钠溶液(10 mLkg)腹腔注射麻醉NOD/SCID小鼠和BALB/c-nu/nu小鼠，小鼠仰卧位固定，用酒精棉擦拭小鼠前胸壁进行消毒;在胸骨左旁3 mm第二肋间、与胸廓成45°夹角的位置，超声引导下将针尖6 mm进入小鼠左心室;确定针尖在左心室后将针回抽，有鲜红色血液不断涌进针管，表明进针正确;随后缓慢地将A549细胞接种入左心室内，慢慢拔出胰岛素注射器，棉签按压止血。GFP/Luc 标记的人肺癌细胞NCI-H1299也采用同样方法建立心内注射骨转移小鼠模型。术后继续饲养，每周定时密切观察小鼠的精神状态及身体状况。
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