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来源：未知 |发布时间：2021-03-27 09:30|点击:次
肝细胞特异性HuR基因敲除实验兔模型的表型研究
人抗原R (human antigen R, HuR)是一种RNA结合蛋白，属于胚胎致死性视觉异常( embryoniclethal abnormal vision, ELAV)家族，在体内广泛表达。
它含有3个保守的RNA识别基序(RNArecognition motifs, RRMs), 其中在RRM2和RRM3之间有一铰链区，内含由52个氨基酸残基组成的HuR核质穿梭区,对其结合mRNA的能力有重要影响。正常情况下，HuR蛋白主要定位在细胞核,但在细胞应激状态下，比如细胞因子、氧化应激、低氧和放射性损伤等刺激时，可能通过下面的两种机制一染色体区域维持蛋白1(chromosomemaintenance protein, CRM1 )或HuR核质穿梭序列(HuR nucleocytoplasmic shuttling sequence, HNS ),HuR蛋白出核发挥作用。在细胞质中, HuR蛋白特异性地与其靶mRNA分子3UTR的AU富集区(AU-rich element, ARE)结合,改变RNA的空间结构,抑制脱腺苷化,提高mRNA的稳定性,促进蛋白表达。HuR在肝脏多种疾病中均扮演着重要的角色。
如在肝炎中，HuR可以促进炎症介质TLRs、IL-6、IL-8、TNF-a、iNOS和COX-2的表达，另外还可调控巨噬细胞的活性，因此被认为是一种关键的促炎因子17-81。对于非酒精性脂肪肝, HuR可通过结合C/EBPβ的3'UTR,在早期脂肪生成时影响其核质运输和mRNA稳定性,而C/EBPβ基因的肝脏特异性敲除表明其有对抗肝脏甘油三酯沉积、内质网应激、氧化应激和炎症的作用。HuR基因的敲降会直接降低APOA4-AS和APOA4的表达,进而调节脂质和血糖的代谢。有更多的研究表明，HuR基因在病毒性肝炎、酒精性肝病、肝纤维化、肝癌、肝再生等过程中都发挥着重要作用问。
本研究利用Cre-LoxP条件基因敲除技术,构建肝细胞特异性HuR基因敲除实验兔模型,探讨在肝细胞中该基因的特异性缺失对肝功能的影响，为后续HuR基因与肝脏相关疾病之间的关联性研究提供动物模型。
1、材料和方法
1.1 实验动物
SPF级HuR雄性实验兔4只( B6.129-Elavl<tml1Thla > /J:stock number:021431)4, SPF级Alb-Cre实验兔雌雄各1只[B6.Cg-Tg (Alb-Cre ) 21Mgn/J:stocknumber:003574]。高脂配方含40%脂肪,普通喂养采用一般维持饲料。采取12 h/12 h的昼夜交替方式进行。实验过程中，实验兔相关的操作处置均按照中华人民共和国科学技楼员会颁布的《实验动物管理条例》相关规定进行,符合动物伦理学管理要求。
1.2 主要试剂
蛋白酶抑制剂; 1 mol/LTris-HCl(pH=6.8)、1 mol/L Tris-HCl(pH=8.0)、1 mol/L Tris-HCl(pH=7.4);山羊抗实验兔荧光二抗-488、山羊抗兔荧光二抗-594;实验兔抗人HuR抗体;实验兔抗人Vinculin抗体;兔抗人、实验兔HNF-4 a抗体; TEMED、过硫酸铵、BCA蛋白浓度测定试剂盒、PBS缓冲液、SDS、Tween-20; GoldviewI型核酸染色剂,琼脂糖。
1.3 方法
1.3.1肝细胞HuR基因特异性敲除实验兔模型的构建:通过HuR实验兔与Alb-Cre实验兔杂交获得F1代，PCR法检测其基因型，选取HuRltAIb-Cre F1代和亲代HuR回交,选育F2代HuR/Alb-Cre和HuR实验兔合笼杂交,获得大量F3代HuRl/AIb-Cre实验兔(实验组)和HuR实验兔(对照组)。
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