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来源：未知 |发布时间：2021-03-24 09:09|点击:次
1材料和方法Materials and methods
1.1设计小鼠口内构建诱发性根尖周炎模型。
1.2时间及地点 于2019年3月至9月在大连医科大学实验
动物中心及口内实验室完成。
1.3材料
实验动物: SPF 级6周龄C57BL/6雌性小鼠25只，体质量18-20g，健康状况可，购于大连医科大学SPF实验动物中心。
主要实验仪器:立式电动牙钻机、HM525冰冻切片机超低温保存箱、数显电热恒温培养箱、光学显微照相系统、Real time PCR仪。
主要实验试剂: DAB 显色试剂盒、苏木精-伊红(HE)染色试剂盒、白细胞介素24多克隆抗体、 PV-9001抗兔免疫组织化学试剂盒、Tritrol 试剂盒、反转录试剂盒、TB GreenTM PremixEx TaqTM II (TaKaRa)。
1.4 实验方法
1.4.1建立实验动物模型选取 6周龄C57BL/6雌性小鼠25只，按随机原则平均分为5组。全麻下对实验组20只小鼠在其双侧下颌第1磨牙远中窝处开放髓腔，确保髓腔直接接触口腔自然环境，之后分别暴露于口腔7，14, 21, 28 d,设为1周组、2周组、3周组、4周组，而对照组不予以开髓处理，设为0周组。
1.4.2制备标本及冰冻切片各组小 鼠全麻后用40g/L多聚甲醛进行心脏灌注，处死后分离下颌骨并剔除多余软组织，置于40g/L多聚甲醛中4 °C固定2d，然后置于10%EDTA中摇床上脱矿4周，固定时间换液。组织完全脱钙后，分别置于15%、20%蔗糖溶液中脱水各1d，之后进- - 步整理组织并以OCT包埋，之后用液氮速冻，标记后-80 C保存。每个标本用冷冻切片机进行近远中矢状连续切片，厚度6um，按顺序收集待用，-80 °C储存。
1.4.3苏木精一伊红染色观察根尖周部位组织学变化取冰冻切37 °C烤片30 min, PBS 室温洗3次，将苏木素滴满整张切片，确保组织完全染色3-5 min(染色时间根据着色情况适当增加或减少)，流动水冲净后用60 °C温水返蓝，之后将伊红染液完全覆盖组织染色1min左右，流动水冲净后置于上行梯度乙醇中完全脱干水分，再置于二甲苯中以使切片清净透明，最后在切片上滴上中性树胶,覆上盖玻片,轻压实，通风处晾干后镜下拍照。
1.4.4RT-PCR检测根尖周部位白细胞介素24mRNA的表达取各组小鼠下颌第1磨牙根尖组织样本，用Trizol法结合吸附柱分离纯化组织RNA，测定RNA浓度，根据TAKARA反转录试剂盒反应条件生成对应cDNA模板。
白细胞介素24.上游引物序列:GCCAAGCTTATGAATTTTCAACAGAGG，下游引物序列:GCCGTCGACCTAGAGCTTGTAGAATTT;以GAPDH为内参，其上游引物序列: AAA TGG TGA AGG TCG GTGTG，下游引物序列:TGAAGGGGTCGTTGATGG。按照TBGreenTM Premix Ex TaqTM II说明书，八连管每孔各加入25 μL反应体系，混匀后放入PCR仪。采用20Ct法比较样本mRNA的相对变化。
1.4.5免疫组织化学(IHC)染色观察根尖周部位白细胞介素24的表达取冰冻切片37 °C烤片30 min, PBS 室温洗3次，将切片置于体积分数0.3%H2O2溶液中固定15min后用PBS洗3次，在组织周围画圈，用山羊血清封闭液封闭组织15min后白细胞介素24抗体(1 : 500)4 °C孵育过夜(<16h);第2天切片用PBST室温洗3次，圈内组织上滴加反应增强液孵育1h,PBST清洗后再滴加增强酶抗山羊抗兔lgG聚合物孵育1h, PBST清洗后DAB发色，再用苏木精染核，流动水冲净后用60 C温水返蓝，置于上行梯度乙醇中完全脱干水分，再置于二甲苯中以使切片清净透明，最后在切片上滴上中性树胶，覆上盖玻片，轻压实，通风处晾干后镜下拍照。阳性细胞镜下显示为黄褐色。高倍镜下(400x)计数下颌第1磨牙近中根尖区域阳性细胞数，每个组织随机选取5张非连续视野进行计数后取均值。
1.5主要观察指标①根尖周病损区域白细胞介素24阳性细胞的表达量；②根尖周组织白细胞介素24mRNA表达高低情况。
1.6统计学分析通过ImagePro6.0软件进行阳性细胞数统计;相关数据统一表示为xts， 通过统计分析软件SPSS20.0，运用One-way ANOVA法比较各组白细胞介素24表达情况。P<0.05 为差异有显著性意义。
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