实验大鼠固定架在土鳖虫药物对大鼠治疗上的应
来源：未知 |发布时间：2021-03-09 09:27|点击:次
土鳖虫为鳖蠊科昆虫地整或冀地鳖的雌虫干燥体，为中医临床传统用药。其最早记载于《神农本草经》，又称土元、土整子、地乌龟、能活血逐瘀、续筋接骨,临床主要用于跌打损伤、筋损骨折、血瘀经闭以及产后血瘀腹痛等症状。
土鳖虫蛋白质含量占总虫体质量的60%,且所含的氨基酸种类完整,几乎包括构成蛋白质的所有氨基酸。但是,大分子蛋白无法被人体吸收,只能经过胃肠道蛋白消化酶的作用转变为小分子活性肽后方能发挥药效E4-7。仿生酶解动物蛋白制备的活性物质主要以小肽或寡肽形式存在被认为是动物类中药真正起效的物质基础-e1。
中医“血瘀症”是一类疾病的统称,主要包括高血脂、高血压﹑血管狭窄、动脉粥样硬化和脑血栓等病症。其病理表现为全血黏度上升。血细胞压积升高、血小板聚集性增强、电泳时间加长、血管功能失调、促血管生成因子减少、自由基增加和局部组织缺血造成坏死等。
据报道,土鳖虫体内含有具有纤溶活性的物质,具有显著的活血化瘀功效。目前大部分研究是关于土鳖虫干粉和土鳖虫蛋白质具有纤溶活性的报道,土整虫乙醇(水)提取物均可以改善大鼠机体凝血因子。抗氧化/氧化因子的水平,并促进血管生成。
从地鳖虫中分离出3种具有纤溶活性的蛋白质EFF1、EFF2和EFF3,其中EFF2活性最强。而土鳖虫活性肢是由土鳖虫蛋白质经仿生酶解面来,结合蛋白质体内消化过程,推断土鳖虫活性肽具有纤溶活性。但是以土鳖虫活性肽为材料研究其对“血瘀症”的作用机制未见报道。同时对于士鳖虫活性肽中存在的活性小肽组分也没有明确信息。
试验拟以土整虫活性肽为研究材料,基于多种分离方式联合检测手段并行的原则,分离纯化获得土鳖虫活性肽组分,并探讨分离组分对急性血瘀模型大鼠血液流变学。血脂四项指标及血液因子含量的影响,为动物药治疗血瘀证提供新的研究思路和试验依据。
1材料与方法
1.1动物-材料与试剂
土鳖虫药材:中华冀地整;SD大鼠:8周龄,体重180-200g;
凝血酶:500 U/g:
牛血纤维蛋白原:纯度95.3%;
胃蛋白酵(2 500 U/mg) 胰蛋白酶(5000 U/mg):;
大孔吸附树脂:DA201-C型,;
Sephadex G25:;
T-CHO.TG,HDL和LDL试剂盒:;
NO.SOD.t-PA和FIBELISA试剂盒:,
1.2仪器与设备
恒温培养箱:BPH-9082 型,;
恒温水浴锅:HH-601型,;十万分之一天平:MS104 型;
超声振荡仪:KQ2200DV型;
全自动血细胞分析仪:LH 750型;
恒温旋转仪:N-1100VEYeLa型;
多功能电导仪:FE30 型:
小型电渗析仪:LH320型;
膜处理设备:DKH-43型。
1.3方法
1.3.1土鳖虫活性肢的制备根据课题组叩前期的研究,取土整虫药材(过80目筛》500g,加10倍量去离子水,加热至沸,放至室温。用稀盐酸调pH至2.0,加1%胃蛋白酶,37℃酶解1.0 h:再用氢氧化钠溶液调pH至9.o,加1%胰蛋白酵,酶解 3.o h后加热灭酶15 min,放凉后冷藏12 h，离心,收集上清液。调整上清液浓度到5o0 mg/ mL.pH值至6.5,分装人电渗析仪器内,平衡15 min后进行除盐操作2.5 h,收集土鳖虫活性肽溶液,备用。
1.3.2纤溶活性测定采用尿激酶为对照药物进行体外纤溶活性测定,以溶圈面积为纵坐标,尿激酶活力(U)的对数为横坐标进行线性回归,建立标准曲线。
1.3.3土鳖活性肽的分离纯化
(1)超滤和纳滤分离:取土鳖虫活性肽溶液,用截留分子量为3 kDa的超滤膜和截留分子量为1 kDa纳滤膜进行分段,收集分子量>3.1一3,<1 kDa的酵解液,经冷冻干燥后进行纤溶活力测定,筛选出纤溶活力最高的组分。
(2) DA201-C型大孔吸附树脂分离:根据文献[20]修改如下,将1.3.3(1)获得的纤溶活性最高的组分离心过滤后,调整pH值至6.0,上样质量浓度为20 mg/ml,上样体积为0.02 BV,上样流速2 BV/h:上样结衷后吸附3 h。再依次用去离子水.25%乙醇溶液.50%乙醇溶液、75%乙醇溶液进行洗脱,收集各洗脱液后分别冻干后测定纤溶活性。
(3）葡聚糖凝胶G-25分离:将1.3.3《2)获得的纤溶活性最高的组分用去离子水溶解后上样,上祥质量浓度为10 mg/mL。上样体积为0.02 BV,用去离子水进行洗脱,流速为0.2 mL/ min,每 1.0 mL收集一试管,采用可见—紫外分光光度仪检测每个试管在220 nm下的吸光度(A),至最后几个试管的吸光度和去离子水相同时停止洗脱。将各洗脱峰分别冻干并测定纤溶活性。
(4）RP-HPLC分离:将1.3.3《3)获得的纤溶活性最高组分采用RP-HPLC进行分离纯化。色谱条件:色谱柱为Agilent BOZAX300SB-Cx。肢色谐柱;检测波长220 nm:流速1.0 ml./ min;流动相A 为乙腈(含0.1%三氟乙酸流动相B为纯水(0.1%三氟乙酸),梯度洗脱方法为050 min.95%B一50%B:50一65 min.50%B一95%B;进样量50 L。对各洗脱峰进行制备,冻干后进行纤溶活性测定。
此文字最终解释权归河南宜慧康科技有限公司所有：详情请咨询河南宜慧康科技有限公司。
