子宫内膜异位症纤维化小鼠模型构建方法及其应用
子宫内膜异位症(endometriosis,EM)是子宫内膜腺体和间质种植于子宫以外的一种慢性、雌激素依赖性疾病,在育龄期女性中发病率为10%~15%。EM虽是一种良性疾病,却具有发病范围广、症状多样、易转移、易复发的恶性行为,至今其病因及发病机制仍不清楚。目前EM的治疗手段主要包括手术和激素类药物,但疗效均不理想。因此,子宫内膜异位症是妇科学研究的热点和难点之一。
子宫内膜异位症的病理学基础为异位内膜在体内激素的作用下周期性剥脱出血,这种周期性出血长期反复出现引起盆腔粘连、甚至纤维化。研究显示,80%以上的EM患者在初次手术时发现粘连形成,而术后3个月再粘连的发生率又可达50%。随着疾病的进展,盆腔粘连逐渐加重,由轻度EM的亚临床腹膜炎或轻度盆腔粘连,发展至重度EM的严重而广泛的粘连,形成盆腔纤维化,甚至冰冻盆腔,导致患者不孕、慢性盆腔痛,严重影响女性的身心健康。然而,目前EM盆腔纤维化的形成机制尚不清楚。
构建一种高效的子宫内膜异位症动物模型将有助于对本病发病机制的认识和新药的开发,同时可以为探索子宫内膜异位症纤维化发病机制提供理想模型。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1实验动物
90只SPF级6周龄性成熟BALB/c雌小鼠,体重18~20g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司【SCXK(京)2016-0006】,饲养于上海长海医院临床实验中心动物实验室【SCXK(沪)2017-0005】,温度22~25℃,湿度55%~60%,12h光照和12h黑暗交替,实验前适应性饲养1周。所有实验操作均严格遵照动物伦理相关规定执行并通过长海医院伦理委员会审查,批准号:CHEC2019-127。
1.1.2试剂与仪器
苯甲酸β-雌二醇(Sigma,E2758),实验用芝麻油,伊红-苏木精染色剂、小鼠转化生长因子β1(TGF-β1)ELISA检测试剂盒,兔抗鼠E-cadherin抗体(CST,3195S),兔抗鼠CollagenI抗体(Abcam,AB34710),兔抗鼠α-SMA抗体(Abcam,AB5694),兔抗鼠SMMHC-II抗体(Abcam,AB53219)。两套眼科常规手术器械(剪刀、镊子、止血钳：河南宜慧康科技有限公司)、注射用生理盐水、1mL注射器、20mL注射器、细胞培养皿(Corning,USA),RPMI-1640培养基(Gibco,USA),低温离心机、组织包埋机、石蜡切片机、光学显微镜(Olympus,Japan)等。
1.2方法
1.2.1药物配制
称取1.5mg苯甲酸β-雌二醇粉末以50mL实验用芝麻油溶解,配成浓度为30μg/mL的苯甲酸β-雌二醇溶液置4℃冰箱避光保存备用。
1.2.2实验分组
造模前,每日定时对所有小鼠进行阴道脱落细胞涂片(美蓝染色法),连续观察两个动情周期,选取动情周期规律的小鼠用于实验。90只实验小鼠中48只用于子宫内膜异位症模型建立,32只作为假手术组,另外10只作为空白对照,用于模型对比鉴定。用于模型建立的48只小鼠按照1∶2的比例随机分为供体鼠16只和受体鼠32只。32只受体小鼠随机分为4组,每组8只,分别为种植后1周组、种植后2周组、种植后4周组和种植后6周组。
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