Masson染色冰箱取出冰冻切片，蒸馏水润湿玻片30-60s，加入适量苏木精染液染色30-60s，弃去，清洗液冲洗30s，加适量磷钼酸分色液6-8min，弃去，加适量苯胺蓝复染液5min，弃去，无水乙醇冲洗干净，吹干后中性树胶封固，显微镜下观察。染色结果：胶原纤维呈蓝色，肌纤维呈红色，细胞核呈黑色。
1.4.8免疫荧光检测胶原蛋白的表达对皮肤及肺组织切片进行免疫荧光检测，观察胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ、CD31的细胞定位。将冰冻切片血清室温封闭20min，4℃一抗CD31(1∶100稀释)、胶原蛋白Ⅰ(1∶500稀释)、胶原蛋白Ⅲ(1∶500稀释)和胶原蛋白Ⅴ(1∶200稀释)孵育过夜，二抗山羊抗兔IgG(1∶1000稀释)37℃孵育20min，DAB显色，苏木精复染，Hoechst33258用于细胞核染色，显微镜下观察。依照XUE等方法，随机抽取5个区域测定染色强度并计分。不计染色面积所占比例时，将染色强度分为3分(强染色)、2分(中度染色)、1分(弱染色)和0分(无染色)。不计染色强度时，将染色面积比例分为3分(70%-100%阳性免疫反应性)、2分(10%-69%阳性免疫反应性)，1分(1%-9%阳性免疫反应性)和0分(<1%免疫反应性)。每个样本的加权评分通过染色强度评分乘以染色面积所占比例评分进行计算。
1.5主要观察指标①各组小鼠血清中白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、白细胞介素17、转化生长因子β水平；②各组小鼠皮肤及肺组织病理学改变；③各组小鼠皮肤及肺组织胶原纤维数量；④各组小鼠皮及肺组织中胶原蛋白及CD31的表达。
1.6统计学分析采用SPSS13.0软件进行统计分析。符合正态分布的计量资料用x-±s表示，多组间比较使用单因素方差分析，组间多重比较用LSD-t法。使用GraphPadPrism7.0绘制直方图，P<0.05为差异有显著性意义。
2结果Results
2.1脂肪间充质干细胞的诱导分化能力成骨诱导分化后细胞逐渐由长梭形变为多角形，碱性磷酸酶染色后可见黑色或棕黑色颗粒，提示碱性磷酸酶活性较高；茜素红染色后可见细胞内钙化结节呈橘红色，证实脂肪间充质干细胞已成功向成骨方向诱导分化。成脂诱导分化后细胞形态逐渐由长梭形变短并膨胀、呈短梭形。细胞内可见大量被染成鲜红色的脂滴，证实脂肪间充质干细胞已成功向成脂方向诱导分化。
2.2脂肪间充质干细胞免疫表型通过流式细胞术检测脂肪间充质干细胞的表面标志物，其中CD34、CD45及CD11c低表达，CD105、CD90及CD44呈高表达。
2.3系统性硬化症小鼠模型的建立及治疗正常对照组小鼠背部皮肤光滑；博莱霉素组背部皮肤坚硬，有溃疡和皱褶；脂肪间充质干细胞治疗组小鼠病变部位皮肤恢复平滑；PBS对照组小鼠背部皮肤仍然坚硬并存在皱褶。
2.4各组血清中白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、白细胞介素17、转化生长因子β水平博莱霉素组血清转化生长因子β、白细胞介素17、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α水平均明显高于正常对照组(均P<0.01)，脂肪间充质干细胞治疗后血清转化生长因子β、白细胞介素17、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α水平较博莱霉素组均明显降低(均P<0.01)，博莱霉素组及PBS对照组血清各因子水平比较差异无显著性意义(P>0.05)。
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